魏光河，李薇伊

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶402460；2.重慶市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶401121）

豬細(xì)小病毒病是由細(xì)小病毒科豬細(xì)小病毒（Porcine parvoviurs，PPV）引起的以初產(chǎn)母豬產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，偶有流產(chǎn)，但經(jīng)產(chǎn)母豬本身無(wú)明顯癥狀的一種豬繁殖障礙性疾?。?－2］。該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛存在并呈地方性流行，給生豬的繁殖、發(fā)展帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展［3］。目前，免疫接種是豬細(xì)小病毒病的主要防控手段。有關(guān)豬細(xì)小病毒病防控措施的探討報(bào)道較多，影響豬細(xì)小病毒的抗體水平的因素也有報(bào)道，但應(yīng)用具體數(shù)據(jù)佐證影響豬細(xì)小病毒抗體滴度及探討如何提高豬細(xì)小病毒抗體滴度的方法未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇臨床及實(shí)驗(yàn)室常用的3種不同免疫增強(qiáng)劑，探討對(duì)豬細(xì)小病毒抗體滴度的影響，尋找提高豬細(xì)小病毒抗體滴度的新方法及措施，以期應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，并為研制高滴度豬細(xì)小病毒血清奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)支持?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 豬細(xì)小病毒滅活疫苗，批號(hào)1002003，齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)；鹽酸左旋咪唑注射液，批號(hào)20100201，四川鼎尖動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司；豬基因工程α干擾素，批號(hào)09102103，大連三儀動(dòng)物藥品有限公司；蜂膠液，生產(chǎn)日期2010年12月28日，兩年有效期，綿陽(yáng)蜂之吻蜂業(yè)生產(chǎn)；豬細(xì)小病毒乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)100401，武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)場(chǎng)址及試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)豬場(chǎng)為西南大學(xué)榮昌校區(qū)西南養(yǎng)豬場(chǎng)；試驗(yàn)用動(dòng)物為從榮昌縣昌元鎮(zhèn)石河村一個(gè)體養(yǎng)豬戶購(gòu)買(mǎi)的一窩12頭30日齡斷奶的健康榮昌仔豬。該榮昌仔豬及母豬均未免疫接種細(xì)小病毒疫苗，血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)PPV均呈陰性。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)用動(dòng)物分組及免疫接種 將購(gòu)買(mǎi)的仔豬轉(zhuǎn)入試驗(yàn)豬場(chǎng)，觀察7 d，隨機(jī)分為4組，每組3頭，命名為干擾素組、蜂膠試驗(yàn)組、鹽酸左旋咪唑組及單一豬細(xì)小病毒疫苗組。在單一細(xì)小病毒疫苗相同疫苗使用劑量基礎(chǔ)上，將干擾素、蜂膠和鹽酸左旋咪唑分別按表1第1次～第4次免疫添加的不同劑量，將其與豬細(xì)小病毒滅活疫苗混合，頸部肌肉注射于試驗(yàn)豬。其中，第2、3、4次免疫接種均為上次免疫接種后的第7天進(jìn)行；前3次每次免疫接種均在采血后進(jìn)行，第4次采血在加強(qiáng)免疫接種后進(jìn)行（表1）。

1.2.2 血樣的采集及血清的制備 前腔靜脈采血，按5 mL／頭／次分別于前3次免疫接種前采集血液，最后1次加強(qiáng)免疫接種后的第2天從前腔靜脈采集血液。采集鮮血轉(zhuǎn)入滅菌5 mL離心管（有蓋），編號(hào)，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置10 min～15 min，后轉(zhuǎn)入4℃冰箱靜置。取上清液，5 000 r／min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入滅菌的1.5 mL離心管，即為制備的待檢血清，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體效價(jià)的檢測(cè) 參照何啟蓋等［4］建立的乳膠凝集試驗(yàn)方法，根據(jù)豬細(xì)小病毒乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，按表2加樣及判讀結(jié)果。達(dá)到陽(yáng)性凝集反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)，即為血清的抗體效價(jià)。凝集反應(yīng)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：“＋＋＋＋”表示全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；“＋＋＋”表示大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；“＋＋”表示約50%乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁；“＋”表示有少許凝集，液體呈混濁狀；“－”表示液滴呈原有的均勻乳狀。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清加抗原呈“＋＋＋＋”凝集，陰性對(duì)照血清加抗原呈“－”凝集，抗原加稀釋液呈“－”凝集時(shí)，以呈現(xiàn)“＋＋”及其以上凝集反應(yīng)判為陽(yáng)性。

表1 3種不同免疫增強(qiáng)劑免疫程序及劑量Table1 The immunization programs and doses of three different immunopotentiators

1.2.4 3 種免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬細(xì)小病毒抗體消長(zhǎng)規(guī)律的影響

1.2.4.1 效價(jià)平均值的計(jì)算方法 參照姚火春等［5］所介紹的抗體效價(jià)平均值計(jì)算辦法，確定干擾素、蜂膠及鹽酸左旋咪唑分別作為豬細(xì)小病毒免疫接種時(shí)的免疫增強(qiáng)劑各組內(nèi)試驗(yàn)豬一免、二免及三免、四免的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)平均值，以及干擾素組、蜂膠組、鹽酸左旋咪唑組與單一豬細(xì)小病毒滅活疫苗組各組的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)平均值。

1.2.4.2 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬細(xì)小病毒的抗體消長(zhǎng)曲線 以檢測(cè)3種免疫增強(qiáng)劑每組3個(gè)平行樣本的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)為基礎(chǔ)，計(jì)算出左旋咪唑、干擾素及蜂膠作為免疫增強(qiáng)劑監(jiān)測(cè)4次平均豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)，以監(jiān)測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的豬細(xì)小病毒平均抗體效價(jià)為縱坐標(biāo)，作3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬細(xì)小病毒抗體消長(zhǎng)規(guī)律影響的動(dòng)態(tài)變化曲線，并以單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組作對(duì)照。

1.2.5 各免疫增強(qiáng)劑組間豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)的分析 按1.2.5.1所述方法，同法計(jì)算出每種免疫增強(qiáng)劑最后一次免疫接種后豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)的平均值，以此平均值為基礎(chǔ)，單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組作對(duì)照，采取單因素分析法，統(tǒng)計(jì)分析各免疫增強(qiáng)劑組間對(duì)豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)的差異。

1.2.6 免疫接種后豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)個(gè)體間的差異性分析 以單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組為對(duì)照，參照姚火春等［5］所介紹的抗體效價(jià)平均值計(jì)算辦法，確定每頭試驗(yàn)豬只最后一次免疫接種后豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)所對(duì)應(yīng)的孔數(shù)，以此為基礎(chǔ)，采取多重比較法作最后一次免疫接種后各試驗(yàn)豬只與單一細(xì)小病毒疫苗免疫接種豬只間的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)個(gè)體間的差異分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行單因素及多因素統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清樣品

通過(guò)采集各試驗(yàn)仔豬前腔靜脈血液，制備免疫接種前及免疫接種后各試驗(yàn)仔豬的血清樣品各4份，共計(jì)48份待血清樣品。

2.2 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬細(xì)小病毒抗體消長(zhǎng)規(guī)律比較

對(duì)采集的試驗(yàn)前、免疫接種后第7天及以后每7 d的血清樣品進(jìn)行乳膠凝集試驗(yàn)，檢測(cè)各組試驗(yàn)豬的豬細(xì)小病毒抗水消長(zhǎng)規(guī)律（表2）。

2.3 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)的影響

從表2可以看出，添加了免疫增強(qiáng)劑組的試驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體效價(jià)都較單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組高，蜂膠作為免疫增強(qiáng)劑相對(duì)于本次研究的其他兩種免疫增強(qiáng)劑來(lái)說(shuō)免疫效果最好，豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)最高，達(dá)到28，即1∶256，適合作為豬細(xì)小病毒疫苗免疫接種時(shí)的較好免疫增強(qiáng)劑；干擾素和鹽酸左旋咪唑作為豬細(xì)小病毒的免疫增強(qiáng)劑免疫效果較差，四免后平均效價(jià)均接近1∶128；低于蜂膠作為豬細(xì)小病毒免疫接種時(shí)的免疫增強(qiáng)劑效果。僅接種豬細(xì)小病毒疫苗的空白對(duì)照組豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)在最后一次免疫接種后平均為1∶64，相對(duì)蜂膠組、鹽酸左旋咪唑組及干擾素組的細(xì)小病毒抗體效價(jià)要低。

表2 不同免疫增強(qiáng)劑豬細(xì)小病毒抗體消長(zhǎng)規(guī)律Table2 The porcine parvovirus antibody titers in three different immunopotentiators

2.4 各免疫增強(qiáng)劑組間豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)差異分析

采用單因素方差分析，干擾素、鹽酸左旋咪唑免疫增強(qiáng)劑組與單一細(xì)小病毒疫苗組所產(chǎn)生的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)比較，差異均顯著（P＜0.05），蜂膠組與單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組抗體效價(jià)差異極顯著（P＜0.01）；干擾素與鹽酸左旋咪唑組差異不顯著（P＞0.05），干擾素與蜂膠組的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)差異顯著（P＜0.05），蜂膠組與左旋咪唑組的抗體效價(jià)差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 免疫接種后豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)個(gè)體間的差異性分析

采用多重比較法將單一細(xì)小病毒免疫接種組各豬只最后一次免疫接種后的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)與干擾素組、蜂膠組、鹽酸左旋咪唑組的各試驗(yàn)豬只最后一次免疫接種后的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)比較可知，免疫接種后，單一細(xì)小病毒免疫接種組3頭單個(gè)豬只的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)與干擾素組、蜂膠組及鹽酸左旋咪唑組的所有單個(gè)試驗(yàn)豬只的細(xì)小病毒抗體效價(jià)個(gè)體間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

免疫接種時(shí)使用免疫增強(qiáng)劑，是提高被免疫動(dòng)物特異性血清抗體效價(jià)的手段之一，免疫增強(qiáng)劑種類(lèi)、免疫接種劑量、免疫接種途徑、免疫接種次數(shù)和免疫接種間隔時(shí)間的最佳選擇也與提高免疫動(dòng)物特異性血清抗體效價(jià)緊密相關(guān)［6－7］，而母源抗體水平直接影響免疫增強(qiáng)劑的效果。通過(guò)試驗(yàn)豬只的選擇及對(duì)試驗(yàn)豬只豬細(xì)小病毒抗體水平的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)豬只包括對(duì)照組豬只的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)均為零，說(shuō)明該批試驗(yàn)豬只符合本次研究要求。

本研究選擇30日齡左右的9頭健康榮昌仔豬用蜂膠、鹽酸左旋咪唑和干擾素作為免疫接種豬細(xì)小病毒疫苗的免疫增強(qiáng)劑和3頭單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組試驗(yàn)豬的試驗(yàn)中，用蜂膠作為免疫增強(qiáng)劑的試驗(yàn)豬細(xì)小病毒抗體水平達(dá)到1∶32及以上，該組所有試驗(yàn)豬的細(xì)小病毒抗體水平均高于單一細(xì)小病毒疫苗對(duì)照組至少一個(gè)梯度。這與王茹等［8－9］研究報(bào)道的蜂膠具有免疫增強(qiáng)作用，能促進(jìn)血清蛋白和丙種球蛋白含量提高，提高抗體的特異性保護(hù)力等作用機(jī)理一致。在以鹽酸左旋咪唑?yàn)槊庖咴鰪?qiáng)劑的試驗(yàn)組中，試驗(yàn)豬的細(xì)小病毒抗體水平不及蜂膠組，但高于僅免疫接種豬細(xì)小病毒疫苗的空白對(duì)照組，說(shuō)明鹽酸左旋咪唑?qū)ωi細(xì)小病毒疫苗具有一定的免疫增強(qiáng)作用。因?yàn)辂}酸左旋咪唑是咪唑的左旋異構(gòu)體，在免疫方面具有雙重作用，一是恢復(fù)周?chē)?yīng)細(xì)胞的功能，可使低活性的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的功能恢復(fù)到正常水平；二是誘導(dǎo)T細(xì)胞和粒細(xì)胞的分化成熟，T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成致敏淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生MAF和MIF等淋巴因子，進(jìn)一步活化巨噬細(xì)胞［10］。干擾素作為動(dòng)物機(jī)體感染疾病過(guò)程的一種產(chǎn)物，既能通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)合成具有不損害細(xì)胞本身且抗病毒作用的蛋白質(zhì)（AVP）而具有很廣的抗病毒作用；還具備高濃度的IFN可抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和低濃度的IFN可促進(jìn)抗體產(chǎn)生作用等免疫調(diào)節(jié)功能。本次研究表明，干擾素作為豬細(xì)小病毒免疫接種時(shí)的免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)最后一次加強(qiáng)免疫接種時(shí)，試驗(yàn)豬只的豬細(xì)小病毒抗體滴度平均接近1∶128，比單一豬細(xì)小病毒疫苗免疫接種組的平均抗體效價(jià)1∶64相對(duì)高了一個(gè)梯度，應(yīng)證了王忠海、曹瑞兵等［11－14］許多學(xué)者報(bào)道的干擾素的免疫調(diào)節(jié)功能。

隨著第4次3種不同免疫增強(qiáng)劑與豬細(xì)小病毒疫苗同時(shí)免疫接種試驗(yàn)豬只，大部分試驗(yàn)豬只的細(xì)小病毒抗體效價(jià)都有較為明顯的增加，尤以最后一次加強(qiáng)免疫接種后豬細(xì)小病毒血清抗體效價(jià)都較未免疫接種前明顯增高；另外，隨著免疫接種次數(shù)的增加，試驗(yàn)豬個(gè)體間的豬細(xì)小病毒抗體效價(jià)則呈現(xiàn)出平行的或類(lèi)似平行的增長(zhǎng)關(guān)系。本試驗(yàn)研究所測(cè)得的結(jié)果顯示，免疫接種次數(shù)的多少及免疫接種劑量的大小、是否使用免疫增強(qiáng)劑等直接影響豬細(xì)小病毒的抗體水平。

［1］殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版杜，1997：1145.

［2］甄洪花，沈志強(qiáng)，單 虎，等.豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（8）：85－88.

［3］李昌文，仇華吉，童光志.豬細(xì)小病毒研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（1）：36－38.

［4］何啟蓋，陳煥春，吳 斌，等.檢測(cè)豬細(xì)小病毒血清抗體乳膠凝集試驗(yàn)方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（6）：457－459.

［5］姚火春，郭霄峰.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：105－107.

［6］張小飛，楊 倩.復(fù)合粘膜免疫佐劑對(duì)雞小腸細(xì)胞免疫的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（1）：85－90.

［7］穆 楊，周麗梅.不同佐劑對(duì)新城疫疫苗對(duì)雞體液免疫的影響［J］.中國(guó)家禽，2007，29（19）：12－14.

［8］王 茹，謝印乾，沈志強(qiáng)，等.蜂膠的免疫增強(qiáng)作用及其在疫苗中的應(yīng)用［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34（2）：93－95.

［9］ítavol C C B F，Morais1 M G，Ramos1 C L，et al.Green propolis extract as additive in the diet for lambs in feedlot［J］.Revista Brasileira de Zootecnia，2011，40（9）：1991－1996.

［10］牛華星，李淑花，張傳津.鹽酸左旋咪唑－維生素E可溶性粉對(duì)雞免疫功能增強(qiáng)作用的研究［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2009，（8）：3－5.

［11］王忠海.干擾素在狂犬病疫苗中的佐劑效果研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18（24）：17－19.

［12］Mack E A，Kallal L E，Demers D A，et al.Type 1 interferon induction of natural killer cell gamma interferon production for defense during lymphocytic choriomeningitis virus infection［J］.MBio，2011，2（4）：1－10.

［13］Le Bon A，Schiavoni G，D′Agostino G，et al.TypeⅠinterferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo［J］.Immunity，2001，14：461－470.

［14］曹瑞兵，周?chē)?guó)棟等.豬α干擾素對(duì)豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗免疫效果的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（6）：867－872.