張苗苗，王 丹

（1.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院動物科學(xué)系，湖北武漢430070；2.武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司，湖北武漢430070）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是該病毒的天然宿主和貯存者，常造成暴發(fā)性流行，妊娠母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊，常以產(chǎn)死胎為主。新生仔豬感染后，可引起大量死亡，15日齡以內(nèi)死亡率很高，可達(dá)100%，3周齡～4周齡仔豬的發(fā)病率高達(dá)40%～60%，育肥豬感染本病毒后可引起輕微的發(fā)熱，呼吸道癥狀和生長遲緩，后備及空懷母豬感染病毒后可引起不育癥，不發(fā)情、返情、屢配不孕等。公豬表現(xiàn)為睪丸腫脹、萎縮、失去種用能力。該病具有高度傳染性，易在豬群間不斷傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因無有效藥物用于偽狂犬病的防控，對其控制主要依賴于疫苗免疫接種。而疫苗的效價（病毒含量）是始終困擾生產(chǎn)企業(yè)的問題，病毒含量的高低決定了疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣，影響病毒含量高低的因素有很多，其中溫度是一個不能忽視的重要因素。本研究通過對相同條件下生產(chǎn)的同一批次的偽狂犬病病毒HB－98株的病毒液抗原和凍干成品在不同溫度下保存的病毒含量進(jìn)行追蹤測定，進(jìn)一步了解該病毒的部分生物學(xué)特性，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一些數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒 豬腎傳代細(xì)胞（IBRS－2），購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心；原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），由武漢科前生物制品有限公司實(shí)驗(yàn)室制備。

偽狂犬病病毒TK－／gG－／LacZ＋突變株 HB－98株毒種，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病毒室構(gòu)建；偽狂犬病病毒HB－98株病毒液和豬偽狂犬病活疫苗（HB－98株）成品，由武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 試劑和溶液 DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO BRL公司，置2℃～8℃保存。

DMEM培養(yǎng)液：取DMEM 粉末13.5 g溶于950 mL雙蒸水中輕輕攪拌至完全溶解后加入3.7 g Na HCO3，用1.0 mol／L HCl調(diào)p H 至6.8～7.0，定容至1 000 mL，過濾除菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞生長維持液：在DMEM培養(yǎng)液中加入20 mL／L的新生牛血清，100單位／mL的青霉素，100 μg／mL的鏈霉素，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

新生牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司，置－20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 保存期試驗(yàn) 將經(jīng)過無菌檢驗(yàn)合格的豬偽狂犬病病毒HB－98株病毒液抗原分裝于無菌小瓶，分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、3、7、14、21、28 d，以后每隔1周取出測定病毒含量；將經(jīng)無菌檢驗(yàn)、真空度測定合格的豬偽狂犬病活疫苗HB－98株凍干成品分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、7、28 d，以后每隔1月取出測定病毒含量。

1.2.2 病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染（TCID50）測定 將待測病毒（凍干成品先用DMEM維持液恢復(fù)至原量）用DMEM維持液按10倍系列稀釋，即10－1、10－2、至10－10等。將100μL不同稀釋度的病毒液加入96孔培養(yǎng)板中，每個稀釋度8孔，然后加入消化分散的IBRS－2細(xì)胞懸液，稍微振蕩，然后置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察2次，逐日記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，按Reed－Muench法計算TCID50。

Reed－Muench法的計算：先計算出各稀釋度的病毒液引起病變和非病變的累積細(xì)胞孔數(shù)，按下述公式計算出距離比例。

距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－50%）／（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）。

lg TCID50＝高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)＋距離比例×稀釋倍數(shù)的對數(shù)

2 結(jié)果

2.1 偽狂犬病毒HB－98株病毒液的保存期試驗(yàn)結(jié)果

將偽狂犬病毒HB－98株病毒液分裝于無菌小瓶，分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、3、7、14、21、28 d，以后每隔1周取出測定病毒含量，結(jié)果見表1。

表1 偽狂犬病毒HB－98株病毒液的保存期試驗(yàn)（TCID50）Table1 The storage test of pseudo rabies virus HB－98 strain virus liquid（TCID50）

一般情況下，偽狂犬病病毒HB－9株病毒液毒價低于7.05效果會受到一定的影響，保存期試驗(yàn)表明，在2℃～8℃至少可存放3個月。但在－20℃以下存放病毒含量下降較快，故在實(shí)際生產(chǎn)過程中病毒液的存放宜于2℃～8℃存放為宜，但為了保證效果，也宜控制在3個月以內(nèi)。

2.2 豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品的保存期試驗(yàn)

經(jīng)無菌檢驗(yàn)、真空度測定合格的豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、7、28 d，以后每隔1月取出測定病毒含量，結(jié)果見表2。

表2 豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品的保存期試驗(yàn)（TCID50）Table2 The storage test of pseudo rabies virus HB－98 product（TCID50）

一般情況下，偽狂犬病毒HB－9株病毒液毒價低于6.6效果會受到一定的影響，保存期試驗(yàn)表明，豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品在－20℃以下至少可存放18個月，病毒含量無明顯差異，但在2℃～8℃存放，隨著時間推移，病毒含量稍有下降，故在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)以－20℃以下存放為宜。

從表1和表2結(jié)果表明，在不同保存條件下不同時間病毒液的質(zhì)量是不一樣的。病毒液在－20℃以下保存一段時間病毒含量下降較快，而在2℃～8℃存放病毒含量下降相對較慢，故在實(shí)際抗原生產(chǎn)過程中宜采用2℃～8℃保存?zhèn)慰袢】乖?，特別是進(jìn)行抗原儲備時盡量避免抗原反復(fù)凍融。而對于凍干后的成品疫苗，在保存期內(nèi)還是盡可能采用－20℃以下保存。

3 討論

病毒含量是衡量一個疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的一個非常重要的指標(biāo)，病毒含量的高低往往決定了疫苗效價的高低，也就決定了疫苗的質(zhì)量。在實(shí)際生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存、使用過程中影響抗原或疫苗病毒含量的因素很多，溫度是最重要的一個因素。在抗原生產(chǎn)過程中，由于生產(chǎn)檢驗(yàn)需要一定的周期，生產(chǎn)出的病毒液抗原不可能立即投入到下道工序，必須經(jīng)過一定時間的儲存；另外，不同廠家可能由于產(chǎn)能的限制，需要進(jìn)行一定數(shù)量的抗原儲備，故需要對抗原進(jìn)行一段時間的存放，這就必須要求合格的抗原在經(jīng)過一定時間的存放后依然保持較高的病毒含量。本研究表明，病毒液抗原在2℃～8℃保存其病毒含量下降的要慢些。但在本研究過程中還發(fā)現(xiàn)，在風(fēng)冷冷庫中保存一段時間后抗原病毒含量下降較快，而相同的病毒液抗原在同一溫度冰柜中保存則病毒含量下降相對較慢。分析原因可能是風(fēng)冷冷庫有自動化霜時間，在化霜時冷庫溫度是要上升的，這樣抗原溫度也隨之升高，這就相當(dāng)于將抗原進(jìn)行反復(fù)凍融，因此保存一定時間后其病毒含量下降很多。因此，在我們實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡量將抗原放置在溫度相對恒定的容器中保存，或在很短時間內(nèi)將其用完，盡量避免長期儲存。對于進(jìn)入運(yùn)輸使用過程中的成品疫苗，在生產(chǎn)廠家由于其自身的硬件環(huán)境及管理措施比較到位，冷庫的溫度一般來講不會出現(xiàn)問題，但在實(shí)際短途運(yùn)輸過程中，特別是在基層農(nóng)戶使用過程中，往往由于受實(shí)際情況的約束，不可能始終保證理想的保存溫度，本試驗(yàn)證明，短時運(yùn)輸也不會影響成品質(zhì)量，但也要盡量避免在高溫下暴露，這樣才能保證疫苗的質(zhì)量。

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