苗立中，沈志強(qiáng)，韓文瑜

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

副豬嗜血桿菌病被稱為豬革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophlius parasuis，HPS）感染引起的豬的一種傳染病［1］。近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的新發(fā)典型細(xì)菌性疾病［2］，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國對副豬嗜血桿菌病的診斷主要通過傳統(tǒng)的病原分離與培養(yǎng)、血清學(xué)方法以及常規(guī)分子生物學(xué)方法。但由于HPS對營養(yǎng)要求苛刻，直接從病料中很難分離到HPS，且該菌培養(yǎng)期間易發(fā)生雜菌污染，不易純化［3］。已有多位學(xué)者建立了檢測HPS的PCR方法，但是這些常規(guī)PCR方法無法對病料中的HPS進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，而且都較繁瑣，容易出現(xiàn)假陽性，檢測結(jié)果具有波動性［4－5］。因此，有必要建立一種新的定量檢測技術(shù)。

Real－time PCR是在PCR定性技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，為實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增并進(jìn)行定量解析的方法。Real－time PCR具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性好及可靠性強(qiáng)的優(yōu)點，同時又實現(xiàn)了對模板的準(zhǔn)確定量，其檢測線性范圍較寬，不易出現(xiàn)假陽性，在整個反應(yīng)過程中可自動通過分析熒光信號記錄數(shù)據(jù)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量分析，解決了PCR假陽性和溴化乙錠（EB）對環(huán)境的污染問題［6］，已成為病原學(xué)檢測的重要手段［7］。

本方法選取HPS的inf B基因中一段高度保守的基因序列作為目的片段，由此設(shè)計一對特異性引物，建立HPS基于SYBR Green I熒光染料的熒光定量PCR快速診斷和定量分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HPS菌株，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點實驗室分離、鑒定和保存；大腸埃希菌DH5α、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門菌、豬大腸埃希菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌等均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑及試劑盒 p MD18－T 載體、Emerald Amp PCR Master Mix（2×Premix）、SYBR Green Real Time PCR Master Mix（2×）、DNA Marker DL 2 000、EASY Dilution（For Real－time PCR）等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；多功能DNA純化回收試劑盒（離心柱型）、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒（離心柱型）和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）均為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 紫外可見分光光度計（2000／2000C型）為北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；Real－time PCR儀（light Cycler480 II型）為德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；直流電泳儀（DYY－8C型）為北京市六一儀器廠生產(chǎn)；BIO－RAD PCR儀為BIO－RAD公司產(chǎn)品；紫外透射反射儀（WD－9403C型）為北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中 HPS的infB基因的序列（DQ：781933.1），設(shè)計一對特異性引物，目的片段長度為129 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

inf B－F： 5′－AGTAGCAGCTGACGATGGCGTAAT－3′； infB－R： 5′－T CTACACGCTCTGGGTTTGCTTCT－3′。

1.2.2 常規(guī)PCR擴(kuò)增 采用直接水煮沸法從HPS培養(yǎng)液中提取基因組DNA［8］，作為常規(guī)PCR反應(yīng)的模板。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為25μL，其中PCR Master Mix（2×Premix）12.5μL，去離子水10.5 μL，模板DNA 1μL，引物infB－F、infB－R各0.5μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取7μL PCR產(chǎn)物于10 g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

1.2.3.1 目的基因的純化回收 將1.2.2中常規(guī)PCR產(chǎn)物于10 g／L瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切回目的片段，用多功能DNA純化回收試劑盒回收目的DNA，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 目的基因的克隆及鑒定 將回收的HPS的infB基因克隆到p MD18－T載體上，然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑取單個菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，然后用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠鑒定，最后將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

1.2.3.3 重組質(zhì)粒濃度的測定 利用紫外可見分光光度計測定陽性重組質(zhì)粒的濃度，并計算其拷貝數(shù)。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 用EASY Dilution（for real time PCR）將陽性重組質(zhì)粒稀釋至1.0×1010copies／μL左右，再依次做10倍梯度稀釋，分別以109、108、107、106、105、104、103、102、101、100十個拷貝數(shù)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)模板。

1.2.4 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.4.1 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法反應(yīng)條件的優(yōu)化 以標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒為模板，infB－F／R為引物，選用不同的引物濃度、退火溫度、反應(yīng)時間等進(jìn)行Real－time PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果，不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以108、107、106、105、104、103、102copies／μL 7個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，infB－F／R為引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得出各自的動力學(xué)曲線，反應(yīng)結(jié)束后由儀器軟件自動分析閾值，結(jié)合擴(kuò)增曲線計算出Ct值，自動擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出曲線的相關(guān)系數(shù)R2和PCR的擴(kuò)增效率。

1.2.4.3 熔解曲線的建立 熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，由60℃開始做熔解曲線，到95℃結(jié)束，連續(xù)收集熒光信號，以溫度為橫軸，以熒光值變化速率為縱軸建立熔解曲線。經(jīng)軟件分析后獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值。

1.2.5 敏感性試驗 以107、106、105、104、103、102、101copies／μL的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得出能檢測出陽性結(jié)果的最低稀釋度的拷貝數(shù)，同時用常規(guī)PCR對以上每個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測，并比較兩種方法的敏感性。

1.2.6 重復(fù)性試驗 選取108、107、106、105、104、103、102copies／μL濃度梯度的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，每個稀釋度一次進(jìn)行3個重復(fù)。根據(jù)每個稀釋度的Ct值計算變異系數(shù)，確定該熒光定量PCR方法的組內(nèi)重復(fù)性。

1.2.7 特異性試驗 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取大腸埃希菌、巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、沙門菌等豬源性細(xì)菌的基因組，再分別取等量的且同等拷貝數(shù)的樣品DNA，以其為模板，inf B－F／R為引物，以25μL體系且相同條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，與p MD18－T載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，用1.2中的引物對所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，得到一條129 bp左右的DNA片段，與連接前的PCR產(chǎn)物大小一致（圖1）。將經(jīng)PCR鑒定的陽性重組菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，測定結(jié)果與目的片段序列完全一致。

2.2 HPS熒光定量PCR檢測方法的建立

2.2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 優(yōu)化后的熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μL，其中SYBR Green real－time PCR Master mix（2×）為12.5μL，去離子水10.5μL，inf B－F、inf B－R 各0.5μL，標(biāo)準(zhǔn)模板1μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃15 s，58℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；在72℃收集熒光；95℃15 s，60℃30 s，95℃ 建立熔解曲線，1個循環(huán)；40℃10 s。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照以上最佳的優(yōu)化條件，選 擇 108、107、106、105、104、103、102copies／μL 7個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，制作動力學(xué)曲線（圖2）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。動力學(xué)曲線的擴(kuò)增效率為1.951，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為－3.444，縱軸截距為36.63，線性方程為 Y＝－3.444X＋36.63，相關(guān)系數(shù)為0.998 8，表明線性關(guān)系很好。

圖2 熒光定量PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線／（copies·μL－1）Fig.2 Dynamic curve of fluorescent quantitative PCR（copies·μL－1）

圖3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of fluorescent quantitative PCR

2.2.3 熔解曲線的分析 熔解曲線分析可以區(qū)分非特異性擴(kuò)增，以驗證PCR產(chǎn)物的特異性。由圖4可以看出，本試驗的熔解曲線是單峰，表明引物的特異性很好，沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

圖4 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR熔解曲線Fig.4 Melting curve of the SYBR Green I real－time PCR

2.3 敏感性試驗結(jié)果

通常我們認(rèn)為，模板的起始數(shù)越低Ct值則越大，當(dāng)Ct值達(dá)到35以上時，定量檢測結(jié)果是不準(zhǔn)確的。試驗結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR能檢測出的模板最低濃度為10 copies／μL（圖5），而常規(guī)PCR能檢測出的最低模板濃度為1.0×103copies／μL（圖6），這表明熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高100倍。

圖5 熒光定量PCR敏感性試驗／（copies·μL－1）Fig.5 Sensibility test of fluorescent quantitative PCR（copies·μL－1）

圖6 常規(guī)PCR敏感性試驗／（copies·μL－1）Fig.6 Sensibility tests of routine PCR／（copies·μL－1）

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

試驗選 取 108、107、106、105、104、103、102copies／μL的標(biāo)準(zhǔn)模板以優(yōu)化的反應(yīng)條件分別連續(xù)擴(kuò)增3次，結(jié)果顯示，每個梯度的樣本重復(fù)性很好（圖7）。同時，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明，組內(nèi)重復(fù)性試驗變異系數(shù)小于2.5%，說明該方法具有較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性（表1）。

表1 熒光定量PCR的組內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果Table1 Intra repeatability test of fluorescent quantitative PCR

圖7 熒光定量PCR重復(fù)性試驗Fig.7 Repeatability test of fluorescent quantitative PCR

2.5 特異性試驗結(jié)果

以豬胸膜肺炎放線桿菌、豬沙門菌、豬大腸埃希菌、豬巴氏桿菌的DNA，進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果這些細(xì)菌的擴(kuò)增曲線始終沒有出現(xiàn)上揚，幾乎為水平線，表明該方法有很好的特異性。

3 討論

在熒光定量反應(yīng)中，16 SrRNA基因不能鑒別HPS和某些同源性細(xì)菌，而inf B基因在種屬間的變異率較低且兼顧有不同血清型之間的保守序列［9］，因此本試驗選取HPS的inf B基因中的一段高度保守的序列作為目的片段，由此保證了該檢測方法的通用性。

SYBR GreenⅠ染料可以與雙鏈DNA分子的小溝結(jié)合，其熒光強(qiáng)度的增加與雙鏈DNA的數(shù)量成正比，從而保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，以達(dá)到進(jìn)行實時定量的目的。由于SYBR GreenⅠ染料與雙鏈DNA的結(jié)合沒有特異性，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增［10］，因此，試驗需要對熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)檢測的特異性和準(zhǔn)確性。本試驗通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，在退火溫度為58℃，獲得的熔解曲線只有1個特異性峰值，表明該反應(yīng)為特異性擴(kuò)增，沒有出現(xiàn)引物二聚體和其他非特異性的擴(kuò)增。

試驗結(jié)果表明，實時熒光定量PCR方法運用于檢測副豬嗜血桿菌具有快速、高效、靈敏的優(yōu)點，并且實現(xiàn)了對模板的準(zhǔn)確定量。該方法檢測的線性范圍較寬，因此不易出現(xiàn)假陽性，在整個反應(yīng)過程中可隨時對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量分析，具有無污染性和實時性等優(yōu)點，解決了常規(guī)PCR檢測方法中存在的費時費力、容易污染及檢測結(jié)果波動性的問題。因此，實時熒光定量檢測副豬嗜血桿菌技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

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