唐 娜，孫翠平，王文秀，張 倩，苗立中，管 宇，沈志強＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

山羊痘（Goatpox）、綿羊痘 （Sheeppox）和牛結(jié)節(jié)性皮膚?。↙umpy skin disease）是分別由羊痘病毒屬（Capripoxvirus）的3種病毒引起的山羊、綿羊和牛的痘病，自20世紀(jì)50年代開始流行，期間雖然得到一定的控制，但仍然持續(xù)流行于非洲、中東和亞洲的多個國家和地區(qū)［1－2］，近幾年，隨著全球氣候變化以及動物、動物產(chǎn)品貿(mào)易方式的改變，這3種痘病的流行更加猖獗，是危害經(jīng)濟動物最嚴(yán)重的痘?。?］。研究表明，感染山羊和綿羊的病毒株具有一定的宿主特異性，山羊痘病毒往往引起山羊發(fā)病，綿羊痘病毒也只感染綿羊，但這種情況并不絕對，有些毒株對山羊和綿羊均可致病［4］。與其他痘病毒相似，動物抵抗過這3種羊痘病毒感染后可以獲得長期的、高水平的抗感染免疫，而且，目前所有報道的羊痘病毒株均具有抗原同源性，動物感染過其中一株病毒后，即可對其他所有毒株產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此人們可以采用一株毒株研制疫苗，用于預(yù)防3種羊痘病毒病［5］。

目前，國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的羊痘病毒疫苗仍然以減毒活疫苗、滅活苗為主［6］。我國研發(fā)的山羊痘細(xì)胞弱毒AV41株作為一種細(xì)胞弱毒，具有較好的免疫原性，被廣泛應(yīng)用于山羊痘與綿羊痘的預(yù)防［7］。研究表明，山羊痘病毒在羔羊睪丸細(xì)胞上增殖效果最好，其此是羔羊腎細(xì)胞，在犢牛睪丸細(xì)胞、犢牛腎細(xì)胞等細(xì)胞中的增殖效果不明顯，可能與各細(xì)胞系對病毒敏感性有關(guān)［8］。目前，國內(nèi)進行山羊痘細(xì)胞弱毒AV41株生產(chǎn)的常用細(xì)胞是綿羊睪丸細(xì)胞，通常采用4月齡以內(nèi)雄性綿羊制備而成［9］，由于制備細(xì)胞需要新鮮組織、組織中細(xì)胞數(shù)量少、羔羊成本較高，以及動物福利等多方面因素，山羊痘疫苗的產(chǎn)量受到很大限制。為擴大生產(chǎn)用細(xì)胞范圍，降低成本，本實驗室分別制備綿羊睪丸細(xì)胞、綿羊腎細(xì)胞、犢牛睪丸細(xì)胞，對山羊痘病毒AV41株在3種細(xì)胞上的生長特性進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 山羊痘細(xì)胞弱毒AV41株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由山東綠都生物科技有限公司保存。

1.1.2 試驗用動物 雄性綿羊，1月齡～4月齡健康雄性綿羊，經(jīng)檢測未感染山羊痘病毒和牛病毒性腹瀉病毒。雄性犢牛，出生3日以內(nèi)、未吃初乳的健康雄性犢牛，經(jīng)檢測未感染牛病毒性腹瀉病毒。安檢山羊，來源于山東濱州地區(qū)非疫區(qū)和非免疫群的12月齡～24月齡健康山羊。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞制備 30日齡～60日齡健康綿羊3只，無菌采取睪丸組織和腎臟，按照常規(guī)方法去除脂肪和包膜，剪碎，洗滌，消化和分散細(xì)胞，制備成原代綿羊睪丸細(xì)胞和綿羊腎細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基和100 mL／L犢牛血清作生長液，細(xì)胞計數(shù)后按照每瓶5×106個細(xì)胞的量分裝到T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，觀察其生長情況。無菌采取3只健康新生犢牛睪丸組織，同上方法制備犢牛睪丸細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞最大傳代次數(shù)比較 以上3種原代細(xì)胞長滿單層后，分別按照常規(guī)方法進行消化、傳代，連續(xù)傳代10代～20代，觀察各代次細(xì)胞生長情況。

1.2.3 山羊痘病毒接種培養(yǎng)觀察 選擇生長良好的綿羊睪丸細(xì)胞、綿羊腎細(xì)胞、犢牛睪丸細(xì)胞單層，分別按照細(xì)胞培養(yǎng)液的1%接種山羊痘病毒毒種，吸附1 h后棄去毒液，加入細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)觀察。待細(xì)胞病變75%以上時，收獲病毒液，凍融后再次分別接種對應(yīng)細(xì)胞，連續(xù)傳代5代。記錄細(xì)胞病變時間、病變形態(tài)等生長特性，收集各代次培養(yǎng)物進行病毒TCID50測定。

1.2.4 TCID50測定 制備鋪有適宜密度的原代綿羊睪丸細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時將不同細(xì)胞培養(yǎng)的山羊痘病毒按照1∶10－1，1∶10－2，……，1∶10－7的梯度做倍比稀釋，分別等體積接種到各細(xì)胞板中，培養(yǎng)觀察5 d，記錄細(xì)胞病變情況。按照Reed－muench公式計算病毒TCID50濃度。

1.2.5 特異性檢驗 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的山羊痘P32基因序列（登錄號：HM572329）參考Chu Y等［10］設(shè)計引物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用SDS－蛋白酶K法分別抽提第5代病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA。PCR反應(yīng)體系：10×Taq Reaction buffer（含 MgCl2）2.5 μL，d NTP（10 mmol／L）2 μL，上游、下游引物 Pl、P2（10 pmol／μL）各1μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U／μL）0.5μL，滅菌雙蒸水16μL；反應(yīng)條件：95℃5 min；94℃40 s，55℃40 s，72℃40 s，33個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物于12 g／L瓊脂糖凝膠電泳并觀察。

1.2.6 安全性檢驗 參考文獻［9］進行安全性檢驗，選取1歲～2歲健康山羊9只，分成3組，每組3只，分別胸腹部皮內(nèi)注射由綿羊睪丸細(xì)胞、綿羊腎細(xì)胞、牛睪丸繼代細(xì)胞生產(chǎn)的山羊痘病毒（稀釋成每1.0 mL含4×103.5TCID50），每只2點，每點0.5 mL，觀察15日，記錄局部痘腫反應(yīng)情況，以及體溫、精神、食欲等是否出現(xiàn)異常狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 3種原代細(xì)胞的制備與生長特性

分別無菌采取綿羊羔睪丸、綿羊羔腎臟、犢牛睪丸組織，制備成原代綿羊睪丸細(xì)胞、綿羊腎細(xì)胞、犢牛睪丸細(xì)胞，通過細(xì)胞計數(shù)計算每份組織3種細(xì)胞的平均細(xì)胞數(shù)量分別為1.10×108±0.55×108、2.5×109±0.19×109、4.9×108±0.40×108個。原代綿羊睪丸細(xì)胞在4 d～5 d能夠長成單層，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞分裂能力下降，生長速度減緩。傳代至第6代～7代后，綿羊睪丸細(xì)胞已經(jīng)無法在7 d內(nèi)長滿單層。犢牛睪丸細(xì)胞生長形態(tài)與綿羊睪丸細(xì)胞相似，綿羊羔腎細(xì)胞生長速度較快，并且可以連續(xù)傳代10代～15代。

2.2 山羊痘病毒AV41株在3種細(xì)胞上的生長特性比較

山羊痘病毒AV41株在3種細(xì)胞上均能造成細(xì)胞病變，但在病變時間、病變形態(tài)等特征上差異明顯。山羊痘病毒在接種綿羊睪丸細(xì)胞后3 d～4 d出現(xiàn)病變，病變細(xì)胞發(fā)生圓縮，聚集，最后成團脫落至培養(yǎng)液中［11］（圖1A）。接種綿羊腎細(xì)胞后平均4 d發(fā)生病變，細(xì)胞先變細(xì)變長，細(xì)胞間隙增大，然后細(xì)胞開始發(fā)生圓縮，聚集，最后脫落，病變持續(xù)時間較長（圖1C）。接種犢牛睪丸細(xì)胞后病變產(chǎn)生較慢，平均5.5 d發(fā)生病變，細(xì)胞病變形態(tài)與綿羊睪丸細(xì)胞相似，病變持續(xù)時間稍長（圖1E）。AV41株在3種細(xì)胞上連續(xù)傳代5代，分別接種鋪有綿羊睪丸細(xì)胞96孔培養(yǎng)板進行TCID50測定，各代次的TCID50結(jié)果均較為穩(wěn)定，分別平均為10－6.125、10－5.5、10－5.875／mL。

2.3 GPV特異性鑒定

采用PCR方法鑒定各細(xì)胞傳代5代后的細(xì)胞培養(yǎng)液，電泳結(jié)果見圖2。各細(xì)胞樣品在495 bp左右均出現(xiàn)了GPV特異性條帶，陰性對照樣品未出現(xiàn)條帶。

2.4 安全性檢驗結(jié)果

接種后3 d，各組山羊相繼出現(xiàn)痘腫反應(yīng)，5 d～6 d時達到最大（直徑1.5 cm～3.5 cm），呈微紅色或無色，此后開始逐漸消退，整個觀察期間，各組山羊精神良好，食欲正常，體溫?zé)o明顯波動。

3 討論

綿羊羔睪丸細(xì)胞是我國獸藥典規(guī)定的山羊痘活疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞。但是在實際生產(chǎn)中，羔羊睪丸供應(yīng)量小、采集較為困難，所需羔羊月齡小、組織細(xì)胞量小，操作程序復(fù)雜、操作時間長，以及其他方面因素，往往給疫苗生產(chǎn)帶來細(xì)胞得率不高、批間差異大、容易發(fā)生污染等問題，生產(chǎn)成本高、風(fēng)險大、產(chǎn)量不確定。

本文通過試驗比較分析了3種原代細(xì)胞的培養(yǎng)及山羊痘病毒AV41株的增殖效果，從結(jié)果可見，AV41株在綿羊羔睪丸細(xì)胞的生長效果最好，但是1月齡～4月齡的綿羊羔生長速度不一，個體差異較大，其睪丸組織含細(xì)胞量差異較大，有的細(xì)胞量甚至僅接近1只9日齡健康雞胚。而羔羊腎臟體積較大，細(xì)胞含量較多（試驗中為睪丸組織的10倍以上），因此，盡管AV41株在羔羊腎細(xì)胞上的效價是在綿羊羔睪丸細(xì)胞上的1／4，羔羊腎細(xì)胞作為山羊痘病毒疫苗生產(chǎn)細(xì)胞仍然具有一定的優(yōu)勢［12］。如果進一步培養(yǎng)馴化適宜羔羊腎細(xì)胞的克隆疫苗株，將有效地改善目前的疫苗生產(chǎn)現(xiàn)狀。AV41株在犢牛睪丸細(xì)胞上的增殖效價居于羔羊睪丸細(xì)胞和腎細(xì)胞之間，考慮到使用異源動物細(xì)胞制備疫苗可以一定程度上防止種毒返強，并有效避免使用同源動物造成其他疾病的傳播，在具備健康雄性犢牛資源的地區(qū)，可以嘗試采用犢牛睪丸細(xì)胞進行疫苗生產(chǎn)。

但是，考慮到弱毒疫苗存在毒力返強的風(fēng)險，生產(chǎn)操作中涉及布氏桿菌病等生物安全問題、以及動物福利等因素，未來人們?nèi)孕枰ふ铱梢蕴娲?xì)胞的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞［13］，加快山羊痘滅活疫苗的研制與應(yīng)用步伐。

本試驗3種原代細(xì)胞制備的山羊痘疫苗免疫效力是否有差異尚待今后進一步試驗。

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