李霞,劉志丹,秦艷杰

(大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧 大連 116023)

隨著冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，人們開始探討超低溫冷凍保存對精子超微結(jié)構(gòu)以及遺傳物質(zhì)的損傷。林丹軍等[1]檢測了冷凍-解凍復(fù)蘇過程對大黃魚精子超微結(jié)構(gòu)的影響；徐西長等[2]應(yīng)用單細胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)研究了超低溫保存真鯛精子對其DNA的損傷。中間球海膽Strongylocentrotusintermedius作為中國北方重要的養(yǎng)殖種類，研究其精子的冷凍保存對種質(zhì)資源保護、良種培育、人工育苗等具有重要意義。關(guān)于中間球海膽精子超低溫冷凍保存的研究已有一些報道[3-4]，但研究內(nèi)容主要集中在抗凍劑種類、降溫方式及解凍方式的選擇等方面，對精子超低溫冷凍保存的損傷尚未見報道。本研究中，作者采用透射電鏡技術(shù)對超低溫冷凍保存前后精子的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進行了觀察，同時應(yīng)用單細胞凝膠電泳技術(shù)研究了超低溫冷凍保存對中間球海膽精子DNA的損傷，旨在為建立中間球海膽超低溫冷凍保存技術(shù)和凍精質(zhì)量的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中間球海膽取自大連新碧龍海產(chǎn)有限公司。于2009年5—6月和2010年9—11月分別選取性腺發(fā)育成熟的海膽，從中間球海膽圍口膜處注射0.075 mol/L KCl 1 mL，然后單個放在50 mL燒杯中，收集產(chǎn)出后的精子用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 冷凍精子的制備 制備冷凍精子時分為對照組(A0)和試驗組(A1)，方法如下：

試驗組(A1)：將400 μL鮮精與用400 μL消毒海水配制的抗凍劑(體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO+體積分?jǐn)?shù)為6%的甘油+25 mmol/L海藻糖)混合裝入1.8 mL凍存管中，將凍存管放入冰箱(4 ℃)內(nèi)平衡10 min，取出后在液氮面上方15 cm和3 cm處分別停留3 min和5 min，再浸入液氮中冷凍保存。24 h后取出凍存管在(22±2)℃下水浴中解凍。

對照組(A0)：將400 μL鮮精與400 μL消毒海水混合，裝入1.8 mL凍存管中，冷凍、解凍方法同上。

1.2.2 電鏡樣品的制備與觀察 將新鮮精液與各組冷凍精子，分別放入用磷酸緩沖液(pH 7.2)配制的體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛中固定24 h，再用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定2 h后，用梯度乙醇脫水，E-pon812包埋，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在JEM-1200型透射電鏡下觀察并拍照。

在電鏡下觀察各組100個精子的質(zhì)膜、頂體、線粒體、鞭毛等細胞器，并計算各細胞器的畸形率：

畸形率=受損細胞器個數(shù)/總細胞器個數(shù)×100%。

1.2.3 單細胞凝膠電泳 將新鮮精液與解凍后的精液用4 ℃下預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH 7.4)離心洗滌兩次(2 000 r/min)，然后用磷酸緩沖液將精液稀釋至106個/mL。試驗參照Singh等[5]提出的堿性單細胞凝膠電泳方法，略加改進。步驟如下：

1)凝膠片的制備。用PBS配制6.5 g/L常溫熔點瓊脂糖(NMA)溶液，于微波爐內(nèi)加熱熔化，將熔解后的凝膠冷卻至45 ℃待用。取100 μL凝膠滴于預(yù)冷載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，置于冰箱(4 ℃)內(nèi)保存20 min，待瓊脂糖冷卻變硬，取下蓋玻片，形成第一層凝膠；取10 μL精液與70 μL 6.5 g/L的低熔點瓊脂糖(LMA)溶液混勻，制成精子LMA懸液，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4 ℃下放置20 min使LMA硬化，輕輕取下蓋玻片，形成第二層凝膠；隨后在其上滴加75 μL 6.5 g/L LMA，加蓋玻片，形成第三層膠，凝固后取下蓋玻片。

2)裂解。將鋪好膠的載玻片立即浸入預(yù)冷的裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，調(diào)節(jié)pH至10后加入10 g/L肌氨酸鈉，臨用前加入體積分?jǐn)?shù)為1%的TritonX-100和體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO)中，于4 ℃下裂解1 h。

3)電泳。將上述處理的玻片，吸去表面液體。并列放置在水平電泳槽的陽極，然后加入預(yù)冷的堿性電泳液(300 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH>13)，液面高出玻片約2.5 mm，浸泡30 min，使DNA雙鏈充分解旋， 之后在25 V、300 mA條件下，避光電泳40 min。

4)觀察并拍照。取出載玻片吸干水分，用Tris-HCl(0.4 mol/L，pH 7.5)中和3次，每次5 min；隨后滴加50 μL EB(50 μg/mL)溶液，加上蓋玻片染色15 min；避光操作，在熒光顯微鏡(Nikon DXM 1200)下觀察并拍照。

5)圖像分析及數(shù)據(jù)處理。采用CASP彗星圖像分析軟件測量。根據(jù)彗星尾部的DNA含量將DNA損傷程度分為5級：0級(G0)，DNA含量<5%，無損傷，精子核完整；1級(G1)，DNA含量為5%～20%，輕度損傷，可見彗尾，精子核基本完整；2級(G2)，DNA含量為20%～40%，中度損傷，可見明顯的彗尾，精子核縮??；3級(G3)，DNA含量為40%～95%，重度損傷，彗尾熒光信號強而密，并見明顯縮小的精子核；4級(G4)，DNA含量>95%，完全損傷，僅見熒光強而密的彗星，精子核基本消失。每次計數(shù)100個精子，重復(fù)3次，計算各級損傷率[6]以及彗星率:

彗星率=彗星細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，

損傷系數(shù)=∑(Gi級損傷細胞數(shù)×i),i=0～4。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用One Way-ANOVA做單因素方差分析, 差異顯著性水平設(shè)為0.05。試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 正常中間球海膽的精子形態(tài)

在透射電鏡下觀察新鮮精子的超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，中間球海膽精子屬鞭毛型，由頭和尾組成。精子頭部形似“子彈頭”，緊緊包被于平滑的質(zhì)膜下，頭部主要由頂體和細胞核組成。頂體位于前端，呈圓錐狀，前端鈍圓，內(nèi)含電子密度較高的物質(zhì)；細胞核由前到后逐漸變寬，電子密度很高，細胞核外有一層核膜，正常狀態(tài)下核膜和質(zhì)膜不易區(qū)分；核的上端為頂體窩，呈“U”型，窩內(nèi)物質(zhì)電子密度較低，排列疏松(圖1-a)；核后窩位于核的下端，呈倒“V”字型(圖1-b)；線粒體數(shù)目為1個，形態(tài)較大，位于細胞核的后方，近圓形，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜向內(nèi)折形成排列不規(guī)則的內(nèi)嵴(圖1-c)。鞭毛從核后窩內(nèi)伸出，由軸絲和鞘組成，橫切面可見軸絲為典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)(圖1-d)。

2.2 冷凍后中間球海膽精子的形態(tài)變化

觀察發(fā)現(xiàn)，A0組精子線粒體和頂體結(jié)構(gòu)均不完整，質(zhì)膜、鞭毛破損，細胞核裸露(圖1-e)。A1組多數(shù)精子結(jié)構(gòu)完好，但有部分精子的細胞器受損，表現(xiàn)為質(zhì)膜褶皺(圖1-f)，或膨脹舉起，與核膜間隙明顯增大(圖1-g)；頂體腫脹、破裂(圖1-h)或脫落(圖1-i)；線粒體嵴間隙增大，內(nèi)部出現(xiàn)空泡(圖1-j)，甚至線粒體內(nèi)膜破損，內(nèi)嵴減少，呈彌散狀(圖1-k)；鞭毛被膜腫脹，呈波浪狀，“9+2”型結(jié)構(gòu)模糊(圖1-l)。細胞核結(jié)構(gòu)同新鮮精子。各組細胞器畸形率見表1。由表1可見，冷凍對質(zhì)膜和線粒體結(jié)構(gòu)影響較大，對頂體次之。

圖1 中間球海膽新鮮精子和冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的比較Fig.1 Ultrastructural comparison of fresh and post-thawed sperm in sea urchin Strongylocentrotus intermedius

注：a～d 正常鮮精子的亞顯微結(jié)構(gòu)；e A0組冷凍精子，示細胞核裸露； f A1組冷凍精子，示質(zhì)膜褶皺；g A1組冷凍精子，示質(zhì)膜高度膨脹；h A1組冷凍精子，示頂體腫脹變形；i A1組冷凍精子，示頂體脫落；j A1組線粒體，示內(nèi)嵴間隙增大；k A1組線粒體，示線粒體內(nèi)膜解體；l A1組冷凍精子鞭毛縱切，鞭毛外膜腫脹，呈波浪狀。Ac示頂體；N示細胞核；M示線粒體；AF示頂體窩(核前窩)；SS示亞頂體腔；PF示核后窩；F示鞭毛；PM示質(zhì)膜。

Note:a-d Ultrastructure of normal fresh sperm; e Post-thawed sperm in group A0, showing nucleus exposure; f Post-thawed sperm in group A1, showing the swollen plasma membrane; g Post-thawed sperm in group A1, showing swollen plasma membrane;h Post-thawed sperm in group A1, showing the swollen acrosome;i Post-thawed sperm in group A1, showing detachment of acrosome;j Mitochondria in group A1, showing enlargement of mitochondrion cristae space; k Mitochondria in group A1, showing disruption of the external membrane of mitochondrion;l Cross section of flagellum of post-thawed sperm in group A1, showing swolled membrane of flagellum.Ac,acrosome; N,nucleus; M,mitochondria; AF,acrosome fossa; SS,subacrosomal space；PF, posterior nuclear fossa; F,flagellum; PM,plasma membrane.

表1 冷凍前后精子細胞器畸形率的變化

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。

Note:The means with the different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level.

2.3 凍存精子DNA損傷的檢測

用SCGE檢測不同冷凍保護液保存精子后，冷凍精子DNA有不同程度的損傷(表2)。DNA彗星圖見圖2。

由表2可見，A0組、A1組精子解凍后各級損傷情況、彗星率以及損傷系數(shù)與鮮精均無顯著差異(P>0.05)。冷凍精子DNA損傷主要為輕度和中度損傷，重度損傷比率較低，而完全損傷則未發(fā)現(xiàn)。

表2用SCGE檢測中間球海膽鮮精及凍存精子的DNA損傷分級(n=100)

Tab.2C1assificationofDNAdamagedetectioninfleshandfrozen-thawedspermintheseaurchinbySCGE(n=100)

%

圖2 中間球海膽精子SCGE彗星圖Fig.2 Comet image of the sea urchin sperm through SCGE

注：A DNA 0級損傷；B DNA 1級損傷；C DNA 2級損傷；D DNA 3級損傷。

Note:A Damage grade 0 in DNA;B Damage grade 1 in DNA;C Damage grade 2 in DNA;D Damage grade 3 in DNA.

3 討論

3.1 冷凍對精子結(jié)構(gòu)損傷和功能的影響

精子冷凍過程中細胞內(nèi)外冰晶的形成以及細胞內(nèi)電解質(zhì)或大分子物質(zhì)的濃縮(如蛋白質(zhì)等)是造成冷凍損傷的主要因素。細胞內(nèi)外環(huán)境存在一定水分，冷凍時溫度降低會形成冰晶，使細胞器受到機械損傷。同時由于細胞外溶液濃度增加引起細胞嚴(yán)重脫水，胞內(nèi)物質(zhì)濃縮，或者膜破損，胞內(nèi)物質(zhì)丟失，細胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[7]。DMSO、甘油等滲透型保護劑可以增強細胞膜的通透性，能夠滲入細胞內(nèi)部，與細胞內(nèi)的水分子結(jié)合，使得溶液黏性增加，從而弱化水的結(jié)晶，減少冰晶對精子的損傷。所以添加抗凍劑一組冷凍精子的質(zhì)膜、頂體、線粒體、鞭毛等細胞器畸形率較不添加組顯著下降。

用透射電鏡觀察冷凍前后精子的超微結(jié)構(gòu),結(jié)果表明，添加抗凍劑后雖有多數(shù)精子結(jié)構(gòu)完好，但仍有部分精子的細胞器受損，表現(xiàn)為質(zhì)膜膨脹舉起,嵴間隙增大，內(nèi)部出現(xiàn)空泡。頂體破裂或脫落，鞭毛被膜腫脹，呈波浪狀，“9+2”型結(jié)構(gòu)模糊，表現(xiàn)形式的不同和精子個體間的差異有關(guān)。損傷特征與西伯利亞鱘[8]、太平洋牡蠣[9]精子凍存的研究結(jié)果相似。細胞器結(jié)構(gòu)與精子行使正常生理功能密切相關(guān)，如質(zhì)膜具有維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及接受外界刺激的作用；線粒體是精子能量的來源，它為精子的新陳代謝和運動提供能量。Gwo[10]對運動前后精子的線粒體觀察后發(fā)現(xiàn)，運動后線粒體體積變小，數(shù)目也迅速減少，最后完全消失。頂體是精子行使受精功能必不可少的細胞器,頂體變形以及破裂將使得精子不能正常受精。楊培民[11]認(rèn)為，頂體破裂將導(dǎo)致無法識別精卵。精子靠鞭毛的擺動進行運動,鞭毛的畸變也會影響精子的運動能力，使得其進入卵子的幾率降低。細胞器受損后必然導(dǎo)致解凍后精子喪失運動能力，不能完成正常受精。

3.2 冷凍和抗凍劑對DNA損傷的影響

精子細胞核是遺傳物質(zhì)的載體，而DNA作為遺傳物質(zhì)，其完整性對于物種的延續(xù)具有重要意義。關(guān)于冷凍對精子DNA損傷目前有兩種觀點：一種觀點認(rèn)為，冰凍對精子DNA沒有影響，精子作為單倍體細胞，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與體細胞不同，由魚精蛋白濃縮形成超螺旋四聚體，染色質(zhì)高度凝聚，細胞內(nèi)液體成分極少，不會形成冰晶，可以采用冰凍方式保存精子DNA[12]；第二種觀點認(rèn)為，冷凍會造成DNA損傷，精子在從精原細胞逐漸轉(zhuǎn)化為精子的過程中, 在后期丟失了大部分的細胞質(zhì), 從而也就遺失了一部分保護精子細胞免遭氧化損傷的酶類, 而這些酶有利于組蛋白向魚精蛋白的轉(zhuǎn)化[13]。有學(xué)者認(rèn)為，高濃度的抗凍劑可引起精子DNA損傷。魏平等[14]檢測了不同濃度的DMSO對真鯛Pagrosomusmajor精子DNA的損傷，認(rèn)為用體積分?jǐn)?shù)為5%～25%DMSO組成的抗凍劑冷凍精子，解凍后DNA的損傷狀況與鮮精接近，但DMSO的體積分?jǐn)?shù)高于25%時，真鯛冷凍精子DNA的損傷比鮮精顯著加重。陳東華等[15]認(rèn)為，體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO抗凍劑對河蟹Eriocheirsinensis精子DNA的損傷最為明顯。本試驗結(jié)果表明：冷凍以及添加較低濃度的抗凍劑對中間球海膽精子DNA損傷均沒有顯著影響，說明適宜的抗凍劑種類和濃度能夠?qū)覦NA起到較好的保護效果，高濃度的抗凍劑對DNA結(jié)構(gòu)是否有影響還有待進一步研究。

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