張鵬，李興銳，張永奎

(四川大學(xué) 化工學(xué)院制藥與生物工程系，四川 成都 610065)

在生物能源和活性物質(zhì)的開發(fā)中，微藻具有巨大的優(yōu)勢(shì)[1-3]。但在微藻的工業(yè)化開發(fā)中還存在許多瓶頸問題，如優(yōu)良藻種的選育、培養(yǎng)模式的經(jīng)濟(jì)化、藻體采集及后續(xù)可用物質(zhì)的分離和純化等[4-5]。在工業(yè)化培養(yǎng)的藻種中，因小球藻富含蛋白質(zhì)和油脂等成分，其工業(yè)化前景更加誘人。但由于小球藻在生長(zhǎng)過程中懸浮于水面，采收過程中存在一些困難，因而使運(yùn)行成本增加，影響了其工業(yè)化應(yīng)用。

目前，采收小球藻的常用方法有絮凝法、過濾法、離心法和氣浮法等，絮凝法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，可常與其它方法配合使用[1,4-5]。在絮凝法中，選擇絮凝劑是關(guān)鍵。殼聚糖是一種常用的絮凝劑，具有絮凝效果好、絮凝物體積大、絮凝速率快和無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛用于微藻的絮凝中[6-11]。在小球藻的絮凝采收中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究大多集中于絮凝劑的選擇上[6-8,12-13]。研究表明，殼聚糖對(duì)小球藻的絮凝效果較好[6,8,10]，但關(guān)于絮凝后上清液的循環(huán)利用性能的研究較少[8,14-16]。在微藻工業(yè)化生產(chǎn)中，培養(yǎng)液的體積巨大，采集藻體后遺留的上清液若可循環(huán)利用，既可以節(jié)省培養(yǎng)成本，又可以簡(jiǎn)化上清液的后續(xù)處理操作，因而具有一定的經(jīng)濟(jì)意義。本研究中，作者在自制的氣升式反應(yīng)器中培養(yǎng)小球藻，研究了用殼聚糖作為絮凝劑采收小球藻后上清液的循環(huán)利用性能，同時(shí)研究了殼聚糖對(duì)采用多次循環(huán)上清液培養(yǎng)的小球藻的絮凝性能，旨在為工業(yè)化培養(yǎng)藻類的采收及其上清液的循環(huán)利用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用小球藻Chlorellavulgaris(藻種編號(hào)為FACHB—1072)購自中國(guó)科學(xué)院武漢水生研究所。殼聚糖購自上海伯奧生物科技有限公司,脫乙酰度≥90.0%，黏度為0.1 Pa·s。

試驗(yàn)儀器包括UV-1800PC分光光度計(jì)，TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)，85-2恒溫磁力攪拌器等。

SE培養(yǎng)基的配制：將0.25 g NaNO3、0.075 g K2HPO4·3H2O 、0.075 g MgSO4·7H2O 、0.025 g CaCl2·2H2O 、0.175 g KH2PO4和0.025 g NaCl 溶于蒸餾水中，加入A5浸出液1 mL、土壤浸出液40 mL和Fe—EDTA液1 mL，定容至1 L。

A5浸出液的配制：將286 mg H3BO3、181 mg MnCl2·4H2O、22 mg ZnSO4·7H2O、7.9 mg CuSO4·5H2O、3.9 mg(NH4)6Mo7O24·4H2O 溶于蒸餾水中，并定容至100 mL。

土壤浸出液的配制：取未施過肥的花園土0.5 kg置于燒杯或三角瓶中，加入蒸餾水1 000 mL，瓶口用透氣塞封口，在水浴中沸水加熱2 h，冷卻后，在無菌條件下過濾，取上清液。將滅菌蒸餾水加入上清液中至總體積為1 000 mL，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

Fe-EDTA液的配制：將0.1 g Na2EDTA和8.1 mg FeCl3·6H2O分別溶于50 mL蒸餾水和50 mL的HCl(0.1 mol/L)中,然后混勻即可。

1.2 方法

1.2.1 新型循環(huán)模式的設(shè)計(jì) 每次循環(huán)分為4個(gè)步驟，具體操作方法如下：

1)在氣升式反應(yīng)器中培養(yǎng)小球藻。自制氣升式反應(yīng)器體積為3 L，裝液量為2.5 L，通入空氣流量為100 L/h。采用普通白熾燈光照，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照時(shí)間為24 h。第1次循環(huán)中藻液生長(zhǎng)至穩(wěn)定期，取出部分藻液進(jìn)行后續(xù)操作，后4次循環(huán)中藻液在氣升式反應(yīng)器中的培養(yǎng)時(shí)間均為3 d。每天定時(shí)測(cè)定反應(yīng)器中藻液的吸光度值ODi。

2)加入殼聚糖絮凝。取出反應(yīng)器藻液體積的60%(1.5 L)，測(cè)定藻液吸光度值ODa。利用醋酸調(diào)節(jié)藻液的pH為6.00，然后在每升藻液中加入10 mg殼聚糖，利用機(jī)械攪拌器以300 r/min攪拌3 min，攪拌后靜止10 min，測(cè)量距液面2 cm處藻液的吸光度值ODb。

3)過濾分離藻體得上清液。使用慢速定量濾紙抽濾除去沉淀的絮體，得到上清液，取出適量體積的上清液，用于NO-3-N、PO3-4-P的測(cè)定。

4)在上清液中補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)成分。向上清液中補(bǔ)加SE培養(yǎng)基，并用蒸餾水將上清液的體積補(bǔ)加至1.5 L(補(bǔ)加蒸餾水的體積低于0.1 L)，不調(diào)節(jié)上清液的pH為7.00。

至此一個(gè)循環(huán)完成，然后將處理后的上清液加入氣升式反應(yīng)器中，再次進(jìn)行小球藻的培養(yǎng)，如此循環(huán)4次。

1.2.2 分析方法 用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為680 nm處測(cè)定藻液濃度，用吸光度值OD表示小球藻藻液的濃度。采用何臘平等[16]的方法測(cè)定藻液中NO-3-N、PO3-4-P的濃度。

采用下列公式計(jì)算殼聚糖的絮凝效率(μ)：

μ=ODa-ODbODa×100 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 循環(huán)培養(yǎng)小球藻的生長(zhǎng)曲線

從圖1可見：在后4次循環(huán)培養(yǎng)中，小球藻的生長(zhǎng)曲線基本類似，說明小球藻的生長(zhǎng)速率基本相近，而且后4次循環(huán)收獲期藻液的濃度與第1次藻液的濃度非常接近(表1)?？梢娎脷ぞ厶亲鳛樾跄齽捎迷谶^濾后的上清液中補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)成分，然后再次作為培養(yǎng)液，對(duì)微藻的生長(zhǎng)無抑制作用，說明上清液可以數(shù)次循環(huán)利用。

圖1 小球藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of alga Chlorella vulgaris

表1 5次循環(huán)收獲期藻液的吸光度值(λ=680 nm)

據(jù)報(bào)道，微藻在生長(zhǎng)過程中可以產(chǎn)生化感性物質(zhì)，并將此物質(zhì)排放至培養(yǎng)液中，對(duì)其它微藻產(chǎn)生抑制或刺激作用，從而影響其生長(zhǎng)[17-19]。本試驗(yàn)中，利用上清液作為培養(yǎng)液循環(huán)培養(yǎng)小球藻5次，小球藻的生物量及生長(zhǎng)速率均正常，對(duì)藻類的生長(zhǎng)無明顯抑制作用或刺激作用，這可能與藻體的采集及分離方式有關(guān)。雖然上清液中的化感性物質(zhì)會(huì)在絮凝過程中富集，但可以隨絮體一同被過濾掉，因而循環(huán)使用的上清液中化感性物質(zhì)很少。在后4次的循環(huán)培養(yǎng)中，每次循環(huán)反應(yīng)器中剩余的40%藻液可以作為下次循環(huán)培養(yǎng)的藻種，但藻種在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生老化現(xiàn)象[14]，影響藻種的生命活力。如果能接種新鮮的藻種，收獲期藻液的濃度會(huì)更高，這樣會(huì)延長(zhǎng)上清液循環(huán)培養(yǎng)的周期。

2.2 殼聚糖對(duì)藻體的絮凝效率

在每次加入殼聚糖之前，需先利用醋酸調(diào)節(jié)藻液的pH為6.00，然后才能加入殼聚糖進(jìn)行絮凝操作。據(jù)報(bào)道，藻液在不同的pH下具有不同ξ電位值，同時(shí)不同pH值對(duì)殼聚糖在藻液中的作用也有很大影響[13]。藻液pH為6.00左右時(shí)，藻體ξ電位值接近于零，而殼聚糖可以增加其分子鏈的帶正電荷的氨基數(shù)量。根據(jù)絮凝電中和理論，藻液pH為6.00左右時(shí)，殼聚糖的使用量可以降低。每次循環(huán)收獲期的藻液pH在8.00以上，而采用此方式得到的上清液呈酸性，在加入反應(yīng)器后中可調(diào)節(jié)藻液的pH值接近中性，有利于藻體的生長(zhǎng)。

5次循環(huán)絮凝操作中，殼聚糖的使用量均相同(10 mg/L藻液)。從圖2可見，5次循環(huán)中殼聚糖的絮凝效率雖呈下降趨勢(shì)，但絮凝效率均在95%以上。據(jù)報(bào)道，在同一個(gè)培養(yǎng)液中多次使用殼聚糖，會(huì)產(chǎn)生絮凝抑制現(xiàn)象，這與藻體生長(zhǎng)中排放的物質(zhì)有關(guān)[20-21]。但本試驗(yàn)中，殼聚糖均具有較高的絮凝性能，可能與培養(yǎng)液中抑制絮凝物質(zhì)的濃度有關(guān)。

圖2 5次循環(huán)殼聚糖的絮凝效率Fig.2 Efficiency of chitosan flocculation in five cycles

2.3 循環(huán)利用的上清液中NO-3-N和PO3-4-P含量的變化

在每次循環(huán)培養(yǎng)中都要補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)成分，為微藻的生長(zhǎng)和繁殖提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究表明，微藻所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在一個(gè)最佳濃度范圍，低于或高于此范圍都會(huì)對(duì)微藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，甚至導(dǎo)致微藻死亡。在小球藻的培養(yǎng)中，NO-3-N、PO3-4-P濃度對(duì)其生長(zhǎng)有較大的影響，故本試驗(yàn)中研究了5次循環(huán)培養(yǎng)中NO-3-N、PO3-4-P濃度的變化，為上清液中補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)成分提供參考。

本試驗(yàn)中，SE培養(yǎng)基中初始NO-3-N、PO3-4-P的濃度分別為182、153 mg/L。從表2可見，在5次循環(huán)利用的上清液中，NO-3-N的濃度為21.2～28.3 mg/L，PO3-4-P的濃度為13.9～19.6 mg/L，變化范圍不大。這說明藻體利用營(yíng)養(yǎng)成分的能力基本不變，同時(shí)也說明在循環(huán)利用上清液時(shí)必須補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)成分。

表2 5次循環(huán)上清液中NO-3-N、PO3-4-P含量的變化

3 討論

在微藻絮凝采收中，絮凝劑的種類對(duì)絮凝效果和上清液的循環(huán)利用性能有較大的影響。本研究結(jié)果表明，5次循環(huán)培養(yǎng)的上清液中小球藻均能正常生長(zhǎng)，而殼聚糖的絮凝效率也在95%以上，NO-3-N、PO3-4-P含量無抑制積累。這說明殼聚糖在小球藻絮凝采收中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但如果進(jìn)行更多次的循環(huán)培養(yǎng)，效果如何，還需進(jìn)一步深入研究。研究表明：上清液在循環(huán)利用時(shí)，微藻在生長(zhǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)化感現(xiàn)象，通過化感作用影響自身或其它藻體的生長(zhǎng)能力，化感作用的方式為藻體將化感性物質(zhì)排放至培養(yǎng)液中；此化感性物質(zhì)會(huì)改變自身或其它藻體的表面結(jié)構(gòu)，從而影響藻體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力和藻體排放體內(nèi)代謝廢物的能力；在多次循環(huán)的上清液中化感性物質(zhì)勢(shì)必會(huì)積累，不僅會(huì)影響藻體的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)影響絮凝劑對(duì)藻體的絮凝性能，導(dǎo)致上清液的循環(huán)利用性能下降[14,17-21]。而選擇合適的絮凝劑或在多次循環(huán)后改用其它絮凝劑，或者選擇絮體與上清液合適的分離方法，都可降低上清液中化感物質(zhì)的積累，從而提高上清液的循環(huán)利用性能。一些研究表明，殼聚糖對(duì)多種微藻均具有較高的絮凝效率[6,8-11]。但目前關(guān)于上清液循環(huán)利用性能方面的研究較少，希望本研究結(jié)果能為其它微藻的研究提供一些參考資料。

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