陶然，劉瑞, 王晴, 陳吉祥、2

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003;2.蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

哈維氏弧菌Vibrioharveyi是一種革蘭氏陰性的細(xì)菌，廣泛分布于海洋環(huán)境及海洋生物中[1], 能引起海水魚類及其它養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病，是世界上許多國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖對(duì)蝦和魚類的致病菌[2-3]，也是中國(guó)海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類弧菌病的主要病原菌之一，該致病菌給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。哈維氏弧菌的胞外蛋白酶、磷脂酶、溶血素、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、密度感應(yīng)系統(tǒng)等與其致病性密切相關(guān)[6-9]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)細(xì)菌病防治仍然主要依靠化學(xué)藥物及抗生素，由此帶來(lái)的環(huán)境污染、藥物殘留及細(xì)菌耐藥性現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。免疫預(yù)防技術(shù)既安全又無(wú)污染，是水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控最為有效的措施之一。關(guān)于對(duì)哈維氏弧菌全菌滅活疫苗的研究已有成功的報(bào)道，哈維氏弧菌的溶血素、胞外蛋白酶、外膜蛋白等也已用于疾病的免疫防治試驗(yàn)，并表現(xiàn)出較好的免疫效果[10-12]。

微生物在環(huán)境中常受到較多的活性氧自由基的損害。硫氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，是一個(gè)NADPH依賴性的二硫化物還原酶系統(tǒng)，廣泛存在于真核生物和原核生物中[13-14]。硫氧還蛋白系統(tǒng)與體內(nèi)細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)、核酸代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)。硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)是一種NADPH依賴性的包含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，主要功能是催化NADPH將小分子蛋白硫氧還蛋白上的二硫鍵(-S-S)還原成(-SH)2的反應(yīng)，維持trx的還原型，可以維持細(xì)胞自由基的產(chǎn)生和被清除之間的平衡，對(duì)微生物在不良環(huán)境中的生存及病原菌的致病作用有重要作用[15]。

本試驗(yàn)中，作者從致病性哈維氏弧菌中克隆和表達(dá)了硫氧還蛋白還原酶基因，研究了表達(dá)蛋白對(duì)大菱鲆Scophthalmusmaximus的免疫作用，以期探索其作為亞單位疫苗用于哈維氏弧菌病防治的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 哈維氏弧菌VibrioharveyiSF1分離自患病的花鱸Lateolabraxjaponicus，經(jīng)過(guò)常規(guī)生理生化及16S rDNA序列分析鑒定后由中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存[8]。連接質(zhì)粒pMD19-T購(gòu)自大連TaKaRa公司，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自Tiangen 公司，表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、IPTG、各種限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker和DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，Ni瓊脂糖親和層析柱購(gòu)自Novagen公司，預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量購(gòu)自Tiangen公司。兔抗大菱鲆免疫球蛋白為中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗大菱鲆免疫球蛋白血清由中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室制備[16]。主要儀器包括PCR儀(BIO-RAD)、UV-2100 PC分光光度計(jì)(Unico)、凝膠成像儀(BIO-BEST)、MIKRO 22R離心機(jī)(Hittich，Germany)和蛋白電泳儀(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 哈維氏弧菌trxR基因克隆及序列分析 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的哈維氏弧菌全基因組序列及其它弧菌trxR基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-CGCGAATTCCGGGAGAAATGTTCAGCCCTCTA-3′(加下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物5′-CCGCTCGAGGCCACTTATTCAA GCTGCTTTGC-3′ (加下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。用酚-氯仿法提取哈維氏弧菌SF1基因組DNA，PCR反應(yīng)體系為50 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性1 min，55 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸1.5 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA凝膠回收試劑盒純化。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T Simple質(zhì)粒分別用EcoRⅠ 和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收片段連接pMD19-T Simple，用T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，重組質(zhì)粒命名為pMD19-T Simple/TrxR。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切，送上海生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定，在NCBI( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)進(jìn)行序列分析，用Mega 3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 哈維氏弧菌trxR基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá) 根據(jù)已克隆的哈維氏弧菌SF1trxR基因序列分析結(jié)果，使用上述特異性引物，以重組克隆質(zhì)粒pMD19-T Simple/TrxR為模板，擴(kuò)增trxR基因。PCR反應(yīng)條件如前。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a(+)分別用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切?；厥彰盖衪rxR基因片段和質(zhì)粒pET28a(+)，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/TrxR，轉(zhuǎn)化至DH5α中。挑取陽(yáng)性克隆接種于5 mL LB培養(yǎng)液(含30 μg/ mL卡那霉素)中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用PCR擴(kuò)增及酶切鑒定陽(yáng)性克隆。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，即得到重組菌BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR。

將重組菌BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL卡那霉素)中，37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)；取50 μL接種于5 mL相同的培養(yǎng)基中，于37 ℃下振蕩培養(yǎng)3 h，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸取1 mL菌液，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，分別收集菌體和上清液。在收集的菌體中加入20 μL生理鹽水和5 μL 5×SDS-PAGE Loading buffer，混勻后煮沸變性5 min，離心，取上清液后用SDS-PAGE(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠)分析表達(dá)的蛋白。

1.2.3 用Ni瓊脂糖親和層析柱分離純化TrxR蛋白 將5 mL Ni瓊脂糖裝層析柱用10 mmol/L咪唑結(jié)合緩沖液(含20 mmol/ L Tris-HCl, pH為8.0,10 mmol/L 咪唑, 0.5 mmol/L NaCl) 平衡。用10 mmol/L 咪唑結(jié)合緩沖液重懸收集的誘導(dǎo)表達(dá)菌體BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR，在低溫環(huán)境中超聲破碎，在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾后上柱,分別用2倍體積的10 mmol/L的咪唑結(jié)合緩沖液和10倍體積的20 mmol/L咪唑洗滌緩沖液(含20 mmol/L Tris-HCl, pH為8.0,20 mmol/L 咪唑, 0.5 mmol/L NaCl)洗滌。最后用150 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, pH為8.0, 150 mmol/L咪唑, 0.5 mmol/L NaCl)洗脫，收集洗脫液。將純化的蛋白置于透析袋中，于4 ℃下透析24 h。

1.2.4 大菱鲆的免疫和人工感染 將體質(zhì)量約15 g的大菱鲆105 尾隨機(jī)分成3組，在海水中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間，每天換水兩次，水溫為20 ℃，充氣培養(yǎng)。正常飼養(yǎng)48 h后，進(jìn)行免疫試驗(yàn)，其中兩個(gè)對(duì)照組分別注射100 μL生理鹽水和100 μL枯草芽孢桿菌(1×107CFU/mL)；試驗(yàn)組注射100 μL TrxR蛋白(500 μg/mL，含1×107CFU/mL 枯草芽孢桿菌 )。在首次免疫后第3周，對(duì)試驗(yàn)組大菱鲆進(jìn)行第2次免疫，方法同第1次。首次免疫后，每周取一次樣，每組取3尾魚，從尾靜脈采血0.5 mL, 室溫下靜置2 h后移入冰箱(4 ℃)中過(guò)夜。次日，以12 000 r/min離心10 min，分離血清，于-80 ℃下保存，用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)。免疫后第4周，對(duì)每組魚分別肌肉注射0.1 mL哈維氏弧菌SF1 (3.9×108CFU/mL)，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。每天觀察魚的動(dòng)態(tài)，記錄死亡情況，對(duì)部分發(fā)病及死亡魚進(jìn)行病理檢查和病原菌分離，并計(jì)算其相對(duì)免疫保護(hù)力(RPS)：

RPS= 免疫組死亡率對(duì)照組死亡率×100%。

1.2.5 特異性抗體的ELISA檢測(cè) ELISA檢測(cè)按照常規(guī)方法進(jìn)行。在預(yù)備試驗(yàn)中以方陣法測(cè)定抗原的包被濃度為15 μg/mL?？乖瓰榧兓墓S氏弧菌SF1的TrxR蛋白，用PBS稀釋至15 μg/mL。將96孔酶標(biāo)板分別以上述抗原包被過(guò)夜, 將大菱鲆抗血清以2倍系列稀釋度加到各孔中, 初始稀釋度為1∶64，每個(gè)稀釋度并排3孔作為重復(fù)，最后加入100 μL PBS作為空白對(duì)照。以兔抗大菱鲆免疫球蛋白血清(稀釋度為1∶1 000) 和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (稀釋度為1∶2 000)作為一抗和二抗，以TMB顯色緩沖液顯色15 min后, 加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值。試驗(yàn)血清吸光度值(P)=待檢血清OD值-空白OD值, 對(duì)照血清吸光度值(N)=對(duì)照血清OD值-空白OD值，當(dāng)兩者比值P/N>2.1時(shí), 則判斷為陽(yáng)性，陽(yáng)性孔的最大稀釋度即為抗體效價(jià)。用t檢驗(yàn)分析其顯著性，置信度水平為95%(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 哈維氏弧菌trxR基因克隆及序列分析

從哈維氏弧菌SF1基因組中擴(kuò)增出1 133 bp特異性片段(圖1)。DNA序列分析結(jié)果表明，含有960 bptrxR的開放閱讀框(ORF)，編碼為319個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。Blast結(jié)果顯示,該基因編碼的蛋白序列與哈維氏弧菌(ZP_01987461.1)、溶藻膠弧菌(ZP_01261254.1)、副溶血弧菌(NP_797630.1)、 燦爛弧菌(EAP93161.1)、弗氏弧菌(ADT87340.1)的TrxR蛋白序列相似性分別為99%、98%、96%、94%、92%。

注：M為 DL 2000 DNA Marker；1為哈維氏弧菌SF1的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。Note:M, DL 2000 DNA Marker;1,PCR product from Vibrio harveyi SF1.圖1 哈維氏弧菌SF1 trxR基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of trxR gene in Vibrio harveyi SF1

將其氨基酸序列與不同種屬TrxR及相似性蛋白的氨基酸序列通過(guò)Clustal 軟件(Clustalw multiple alignment) 進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Mega 3.1 鄰接法(Neighbor-Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。從進(jìn)化樹可以看出，該蛋白與哈維氏弧菌HY01的TrxR( ZP_01987461.1)聚為同一類群，并與溶藻膠弧菌、副溶血弧菌的TrxR在進(jìn)化上相近。

2.2 哈維氏弧菌trxR基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

將哈維氏弧菌trxR基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中得到陽(yáng)性克隆菌株BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR。將重組菌在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳顯示，誘導(dǎo)后含重組質(zhì)粒BL21(DE3)在相對(duì)分子質(zhì)量為34 000位置上出現(xiàn)了1條明顯的表達(dá)蛋白帶，而不含重組質(zhì)粒的對(duì)照BL21(DE3)菌體中沒(méi)有此蛋白條帶(圖3)； 將菌體裂解液用Ni瓊脂糖親和層析柱分離純化，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，此蛋白條帶相對(duì)分子質(zhì)量約為34 000 (圖4), 與理論值一致。

2.3 重組蛋白TrxR對(duì)大菱鲆的免疫保護(hù)效果

用純化的TrxR蛋白免疫大菱鲆，免疫后第4周，試驗(yàn)組和對(duì)照組用哈維氏弧菌SF1進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

圖2 哈維氏弧菌TrxR的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of TrxR from Vibrio harveyi

注：1為 重組菌BL21(DE3)/ pET28a(+)/TrxR；2為 BL21/(DE3)；3為標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白。Note:1,BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR; 2,Negative control; 3,Protein molecular weight marker.圖3 重組菌BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR表達(dá)蛋白的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of protein in the combinant expressed by BL21(DE3)/pET28a(+)/TrxR

注：1為標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白；2為純化的TrxR。Note:1,Protein molecular weight marker; 2,The purified TrxR.圖4 純化的重組蛋白TrxR 的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant TrxR

結(jié)果表明，對(duì)照組魚在感染第3天開始死亡，并且出現(xiàn)了明顯癥狀，如運(yùn)動(dòng)和攝食能力下降，出現(xiàn)腹水和體表潰瘍等。在感染后2周內(nèi)，對(duì)照組的大菱鲆全部死亡；TrxR免疫組的死亡率為25%，相對(duì)免疫保護(hù)力為75% (表1)。

表1 TrxR蛋白對(duì)大菱鲆的免疫保護(hù)作用

2.4 TrxR免疫對(duì)大菱鲆特異性抗體變化規(guī)律的影響

在免疫后的不同時(shí)期分別取各組魚的血清，用直接ELISA 法檢測(cè)特異性抗體。結(jié)果表明:免疫組在免疫后第1周血清中就出現(xiàn)了特異性抗體，在第3～4周內(nèi)魚血清中特異性抗體維持在較高水平，第2周抗體效價(jià)達(dá)到1∶128;而對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到特異性抗體的存在(圖5)。

圖5 經(jīng)TrxR免疫后大菱鲆血清中特異性抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Serum antibody responses in the turbot vaccinated with the recombinant TrxR by ELISA

3 討論

免疫預(yù)防技術(shù)是水產(chǎn)養(yǎng)殖病害預(yù)防的首選措施。關(guān)于哈維氏弧菌全菌滅活疫苗及亞單位疫苗的研究已有較多報(bào)道。如Zhang等[17]用純化的重組絲氨酸蛋白酶Vhp1免疫牙鲆Paralichthysolivaceus，結(jié)果對(duì)牙鲆的免疫保護(hù)率可達(dá)70 %；Li等[18]報(bào)道了從哈維氏弧菌EcGS020802克隆到相對(duì)分子質(zhì)量為28 000的外膜蛋白OmpK，該蛋白對(duì)斜帶石斑魚Epinepheluscoioides免疫后能產(chǎn)生特異性抗體，免疫保護(hù)率為100%；Zhang等[19]構(gòu)建了哈維氏弧菌的外膜蛋白和甘油醛脫氫酶的融合蛋白，分別用r-OmpK-GAPDH、r-Omp和r-GAPDH以及OmpK與GAPDH的混合物對(duì)大黃魚Pseudosciaenacrocea進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn),單體蛋白和融合蛋白對(duì)魚都有一定的保護(hù)作用，單體蛋白r-Omp和r-GAPDH的免疫保護(hù)率為37.7% 和40.0%, 而融合蛋白r-OmpK-GAPDH的免疫保護(hù)率為70%；與單體蛋白相比，融合蛋白中的OmpK和GAPDH產(chǎn)生了協(xié)同作用。黃輝等[20]從哈維氏弧菌致病菌株基因組中克隆了ompU基因，表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為41 000，以50 μg/mL的劑量注射免疫大黃魚幼魚，用間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體的效價(jià)，結(jié)果表明，4～8 周內(nèi)特異性抗體效價(jià)持續(xù)升高，其log2的值為8.0以上，4周時(shí)對(duì)大黃魚幼魚的相對(duì)免疫保護(hù)率為85%。Sun等[21]從哈維氏弧菌T4基因組中克隆到相對(duì)分子質(zhì)量為22 500的外膜蛋白VhhP2，該蛋白在不同來(lái)源的致病菌中都存在，純化的VhhP2能有效保護(hù)日本牙鲆抵抗哈維氏弧菌的攻毒感染，免疫魚的死亡率為10%，而對(duì)照組的死亡率為93.3%；該蛋白還能有效誘導(dǎo)一些免疫相關(guān)基因的表達(dá)，尤其是IgM和MHC IIα，Mx、IFN、IFN-γ和MHC Iα。免疫試驗(yàn)中，使用枯草芽孢桿菌作為免疫佐劑，可以促進(jìn)蛋白更好的發(fā)揮免疫作用。

硫氧還蛋白系統(tǒng)廣泛存在于生物體內(nèi)，與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)等生理活動(dòng)相關(guān)，有助于微生物適應(yīng)環(huán)境，而且在抵抗細(xì)菌致病性方面可能發(fā)揮重要作用。有關(guān)弧菌硫氧還蛋白還原酶功能研究的報(bào)道較少。本研究中，在哈維氏弧菌SF1基因組克隆的trxR基因序列與溶藻膠弧菌、副溶血弧菌、燦爛弧菌、弗氏弧菌等的TrxR蛋白序列相似性較高，在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為34 000，與大腸桿菌及其它原核生物種的TrxR 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致[22]。這表明TrxR是一個(gè)相對(duì)保守的蛋白。

本研究中采用在大腸桿菌表達(dá)并純化的TrxR免疫大菱鲆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫大菱鲆血清中產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體，4周后對(duì)致病性哈維氏弧菌攻毒感染的免疫保護(hù)率為75%。這表明TrxR可以作為一個(gè)有效候選亞單位疫苗抗原。今后的工作重點(diǎn)將集中于硫氧還蛋白還原酶基因缺失突變株的構(gòu)建及生理特性研究上，以探討其在哈維氏弧菌生理代謝及環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中的作用，同時(shí)進(jìn)一步研究硫氧還蛋白還原酶對(duì)海水魚類的免疫保護(hù)作用機(jī)制及其有效免疫途徑，并將其作為亞單位疫苗用于弧菌病的防治。

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