張 坤 姜妙娜 張彩華 賈玉杰

肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSCs）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[1]，對(duì)HSCs的活化進(jìn)行干預(yù)是臨床治療肝纖維化的發(fā)展方向[2]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種進(jìn)化上保守的蛋白激酶，參與多種病理和生理過(guò)程，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、遷移等過(guò)程密切相關(guān)[3]。研究表明，在實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化模型中應(yīng)用mTOR抑制劑，可降低肝纖維化程度[4]，說(shuō)明mTOR在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。核糖體S6激酶（P70S6K）是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，從而控制含5'-TOP結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯[5]。研究表明，P70S6K參與了HSC表達(dá)膠原的調(diào)控，因而與肝纖維化的發(fā)生關(guān)系密切[6]。但到目前為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)mTOR/P70S6K信號(hào)通路與肝纖維化發(fā)生關(guān)系的研究甚少。

關(guān)于中藥在分子水平包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的研究還很少。實(shí)驗(yàn)證明肝復(fù)康對(duì)肝纖維化具有預(yù)防及治療作用[7～10]。我們通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞-T6（Hepatic stellate cell-T6，HSC-T6），以肝復(fù)康進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)許列明教授惠贈(zèng)。細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

二、含藥血清的制備[11]健康SD大鼠，雌雄不限，體重300～350g，被隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肝復(fù)康治療組，每組10只，分別給予生理鹽水、肝復(fù)康（4.16ml/只）灌胃，每天一次，共七天。最后一次灌胃前禁食12小時(shí)并在灌胃后一小時(shí)腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，4℃、3000rpm離心20分鐘，取血清，過(guò)濾，56℃滅活30分鐘后分裝，-80℃保存。

三、HSCs實(shí)驗(yàn) 將傳代培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞分為三組：正常對(duì)照組：在含10%正常對(duì)照組血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)；乙醛刺激組：在含10%正常對(duì)照組血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L），培養(yǎng)48小時(shí)；肝復(fù)康治療組：在含10%肝復(fù)康藥物血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L），培養(yǎng)48小時(shí)。

四、大鼠肝星狀細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原、mTOR、P70S6K mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。使用TRIzol（Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度，在A260/A280為1.18～2.10。使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（TAKARA公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 7 min。Ⅰ、Ⅲ型膠原、mTOR、P70S6K、β-actin引物序列均采用primer5軟件自行設(shè)計(jì)，其引物序列（TAKARA）及擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：Ⅰ型膠原：上游：5’-TGCCGTGACCTCAAGATGTG-3’，下游：5’-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3’，產(chǎn)物462bp。Ⅲ型膠原：上游：5’-AGATCATGTCTTGACTCAAGTC-3’， 下 游 ：5’-TTTACATTGCCATTGGCCTGA-3’，產(chǎn)物 463bp。mTOR:上游：5’-CGGGATACTCACGATGGA-3’，下游：5’-GTCAAGTTGCCGAGATGG-3’，產(chǎn)物 447bp。P70S6K：上游 ：5’-TTTTGGCTCGGAAGGTGG-3’， 下 游 ：5’-TGTCGGATTGGAAGTGGC-3’，產(chǎn)物 421bp。β-actin：上游：5’-GGTATGGGTCAGAAGGACTCC3’，下游：5’-TGATCTT CATGGTGCTAGGAGCC-3’，產(chǎn)物 847bp。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DNA條帶進(jìn)行吸光度掃描，與相應(yīng)β-actin的比值分別為Ⅰ、Ⅲ型膠原、mTOR、P70S6KmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，取均值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用表示，多組比較采用ANOVA法，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著性意義。

結(jié)果

一、三組HSC-T6細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá) 正常對(duì)照組有Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，但程度較弱；乙醛刺激組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量明顯增加，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異（分別為P＜0.01和P＜0.05）；肝復(fù)康治療組Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)量較乙醛刺激組表達(dá)量明顯下降，有顯著性差異（P＜0.01），與正常對(duì)照組比，表達(dá)量增多，有顯著性差異（P＜0.01），肝復(fù)康治療組Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量與正常對(duì)照組和乙醛刺激組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖 1）。

圖1 各組肝星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、mTOR和P70S6K的表達(dá) 泳道1、2和3分別為正常對(duì)照組、乙醛刺激組和肝復(fù)康治療組

二、三組HSCs mTOR、P70S6K mRNA的表達(dá) 正常對(duì)照組有少量mTOR、P70S6K mRNA的表達(dá)；乙醛刺激組mTOR、P70S6K mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，與正常對(duì)照組相比均有顯著性差異（P＜0.01）；肝復(fù)康治療組mTOR、P70S6K mRNA的表達(dá)量比乙醛刺激組明顯下調(diào)，均有顯著性差異（P＜0.01），同時(shí)與正常對(duì)照組相比，表達(dá)量增多，有顯著性差異（P＜0.01，圖1）。

討論

乙醛刺激HSCs 是酒精性肝病的主要原因，HSCs在乙醛的刺激下表現(xiàn)為細(xì)胞增殖、Ⅰ、Ⅲ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，乙醛作為HSCs的激活劑被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中[12]。在本實(shí)驗(yàn)，乙醛刺激組HSCs表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型膠原增加，說(shuō)明HSCs被乙醛激活。

HSCs的活化過(guò)程是多條信號(hào)通路及一系列細(xì)胞信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)共同參與作用的結(jié)果。TOR是一種絲/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶，首先在酵母中發(fā)現(xiàn)，隨后在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了酵母TOR的同源物，稱為mTOR。mTOR在穩(wěn)定狀態(tài)下存在于胞漿內(nèi)，激活后進(jìn)入胞核調(diào)控下游靶分子4E-BP1和P70S6K。mTOR可以整合細(xì)胞內(nèi)外的生長(zhǎng)因子和環(huán)境壓力等激發(fā)的信號(hào)刺激，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞周期[13]。P70S6K是一種核糖體蛋白激酶，在細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中廣泛表達(dá)和激活，其活性受mTOR、MAPK等多種信號(hào)調(diào)節(jié)，活化后能夠磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白，S6蛋白可促進(jìn)5’TOPmRNA的翻譯，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[14]。5’TOPmRNA可翻譯合成核糖體蛋白、延伸因子eEFlα和eEF2以及mRNA穩(wěn)定蛋白PABP等[15]。本實(shí)驗(yàn)中乙醛刺激組mTOR和P70S6K表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01），說(shuō)明在肝纖維化時(shí)mTOR/P70S6K信號(hào)通路起到一定的作用。

中藥具有多組分、多途徑與多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，針對(duì)纖維化等復(fù)雜疾病可發(fā)揮綜合作用。肝復(fù)康是以丹參、黃芪、赤芍、白芍、柴胡為主要成份的復(fù)方中藥，具有活血化瘀、軟堅(jiān)消癥的功效。本研究顯示，肝復(fù)康治療組HSCs mTOR和P70S6K表達(dá)量較乙醛刺激組明顯下調(diào)，說(shuō)明肝復(fù)康發(fā)揮抗纖維化的治療作用與抑制mTOR/P70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。因此，我們認(rèn)為mTOR/P70S6K信號(hào)通路在HSCs活化、肝纖維化形成過(guò)程中起到重要作用。

[1]Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.J Pathol，2008，214（2）:199-210.

[2]Gressner AM，Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.J Cell Mol Med，2006，10（1）:76-99.

[3]Zheng Y，Collins SL，Lutz MA，et al.A role for mammalian target of rapamycin in regulating T cell activation versus anergy.J Immunol，2007，178:2163-2170.

[4]Patsenker E.Potent antifibrotic activity of mTOR inhibitors sirolimus and everolimus but not of cyclosporine A and tacrolimus in experimental liver fibrosis.J Hepatol，2011，doi:10.1016/j.jhep.2010.10.044.

[5]彭貴主，吳波，單人鋒，等.mTOR/P70S6K信號(hào)通路在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義.世界華人消化雜志，2008，16（29）:3279-3282.

[6]楊妙芳，許小兵，吳文娟，等.核糖體S6激酶對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)膠原表達(dá)的調(diào)控. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（19）:1753-1756.

[7]車穎，徐婷婷，姜妙娜，等.肝復(fù)康膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用. 中藥材，2004，27（6）:428-429.

[8]車穎，徐婷婷，姜妙娜，等.肝復(fù)康抗大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)中藥雜志，2004，29（6）:599-600.

[9]Xu TT，Jiang MN，Li C.Effect of Chinese traditional compound，Gan-fu-kang，on CCl4-induced liver fibrosis in rats and its probable molecular mechanisms.Hepatol Res，2007，37:221-229.

[10]Lou JL，Jiang MN，Li C，et al.Herb medicine Gan-fu-kang attenuates liver injury in a rat fibrotic model.J Ethnopharmacol，2010，128:131-138.

[11]張彩華，崔曉棟，姜妙娜，等.肝復(fù)康不同濃度含藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原及細(xì)胞基質(zhì)的影響.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（33）:6496-6499.

[12]Sonoyama T，Tamura N，Miyashita K，et al.Inhibition of hepatic damage and liver fibrosis by brain natriuretic peptide.FEBS Lett，2009，583（12）:2067-2070.

[13]Rao RD，Buekner JC，Sarkaria JN.Mammalian target of rapamyein（mTOR） inhibitors as anticancer agents.Curr Caneer Drug Targets，2004:4:621-635.

[14]Buck M，Chojkier M A.Ribosomal S-6 Kinase-mediated signal to C/EBP-b is critical for the development of liver fibrosis.PLoS ONE，2007，2（12）:e1372.

[15]Jamison JT，Kayali F，Rudolph J，et al.Persistent redistribution of poly-adenylated mRNAs correlates with translation arrest and cell death following global brain ischemia and reperfusion.Neuroseience，2008，154:504-520.