滿 意 張春勇 陳克嶙 李美荃 郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，昆明 650201)

近年來抗生素使用的弊端日益嚴重，針對抗生素藥物殘留和耐藥性問題，研究和應(yīng)用新型抗生素替代品已成為重要課題內(nèi)容。博落回(M.cordata)在動物生產(chǎn)中，具有廣譜清熱解毒消腫、抗菌等作用。而博落回提取物(MC extracts)是從罌粟科博落回屬植物博落回或小果博落回(M.microcarpa)植株中提取出來的生物堿，作為安全新型抗生素替代品在畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。經(jīng)過前期發(fā)現(xiàn)，添加適宜濃度博落回提取物對仔豬具有明顯的促生長作用，進一步研究博落回提取物是否可作為仔豬免疫和抗氧化調(diào)節(jié)劑具有重要科學(xué)意義。研究表明，博落回提取物中主要含有苯并菲啶類生物堿血根堿和白屈菜紅堿，博落回提取物中的血根堿與白屈菜紅堿具有抑菌、抗腫瘤細胞增殖、保護肝臟、殺蟲等作用[1-4]，博落回在歐盟是允許添加的飼料添加劑之一。Vieira等[5]報道，在火雞飼糧中添加含有博落回提取物的飼料添加劑，結(jié)果表明添加32.8 mg/kg博落回提取物能提高火雞采食量，在35日齡時有最大的飼料轉(zhuǎn)化率。饒華等[6]研究表明，血根堿和博落回提取物均能顯著提高斷奶仔豬的生長性能，有效緩解了斷奶應(yīng)激。滿意[7]研究表明，博落回提取物顯著改善仔豬生產(chǎn)性能、免疫性能和抗氧化能力，仔豬飼糧適宜添加量為4.5 mg/kg。生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機化合物，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一，生物堿具有提高機體免疫力和抗氧化能力的作用，但其作用機制仍不清楚，對博落回提取物是否通過影響動物相關(guān)基因表達而改善機體免疫性能和抗氧化能力的研究資料很少，迄今為止，博落回提取物對豬免疫球蛋白G(IgG)和超氧化物歧化酶(SOD)mRNA表達影響的研究鮮見報道。本試驗旨在通過脂多糖(LPS)誘導(dǎo)豬細胞以建立應(yīng)激細胞模型，檢測細胞應(yīng)激參數(shù)的變化，采用實時熒光定量PCR法，研究博落回提取物對豬應(yīng)激和正常細胞IgG和SOD mRNA表達的影響，探討博落回提取物對豬細胞內(nèi)源IgG、SOD mRNA的誘導(dǎo)作用，為博落回提取物對豬抗病營養(yǎng)作用機理的研究提供新的試驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬胚胎背部皮膚成纖維細胞為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)實驗室冷凍保存。

本試驗使用博落回提取物總生物堿含量≥60%，其中含血根堿45%、白屈菜紅堿19%[7]。土霉素為廣州中邦生物科技有限公司產(chǎn)品。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12細胞培養(yǎng)液)、胎牛血清、青霉素 -鏈霉素雙抗、胰酶，均購自美國Gibco公司;LPS購于美國Sigma公司;IgG含量采用全自動生化分析儀檢測;乳酸脫氫酶、溶菌酶、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(PrimeScripRT Reagent Kit with gDNA Eraser)及熒光定量PCR試劑盒(SYBPremix Ex TaqTMⅡ)均購自日本TaKaRa公司。

利用Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計，并用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast工具確認引物的特異性，選用在豬機體內(nèi)穩(wěn)定表達的3個基因β-肌動蛋白(ACTB)、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、TATA框結(jié)合蛋白(TATA box binding protein，TBP)作為看家基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列及參數(shù)見表1。

1.2 LPS對細胞的抑制率的檢測

采用6孔板和基礎(chǔ)培養(yǎng)液細胞，收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1 000～10 000個/孔。5%CO2、37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底。加入LPS使其終濃度為 5、10、15 μg/mL，每個處理 3 個重復(fù)，每孔為1個重復(fù)。5%CO2、37℃孵育12～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL甲基噻唑基四唑(MTT)溶液(5 mg/mL，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量吸光度(OD)值，同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基+MTT+二甲基亞砜)和對照孔(細胞+相同濃度的藥物溶解介質(zhì)+培養(yǎng)基+MTT+二甲基亞砜)。觀察細胞，計算細胞的抑制率。

細胞的抑制率(%)=100×(對照孔OD-培養(yǎng)后細胞OD)/對照孔OD。

1.3 試驗設(shè)計

細胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，傳代培養(yǎng)，當(dāng)細胞長滿培養(yǎng)瓶時進行以下處理。

LPS溶解于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中至終濃度為10 μg/mL，培育12 h后得到LPS應(yīng)激細胞。

試驗設(shè)計見表2，正常細胞和應(yīng)激細胞分別進行處理，對照組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，土霉素組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加土霉素50 μg/mL(陽性對照組)，博落回組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加50、100、150 ng/mL的博落回提取物。每個處理3個重復(fù)，1個孔為1個重復(fù)。各組細胞在37℃的條件下培養(yǎng)24 h后，收集各孔細胞液，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃冰箱保存待測。所有樣品參測細胞的抑制率、IgG和SOD mRNA表達量;應(yīng)激細胞上清液進行應(yīng)激參數(shù)的檢測。

表1 引物序列及參數(shù)Table1 Sequences and parameters of primers

表2 試驗設(shè)計Table2 The experimental design

1.4 應(yīng)激參數(shù)的檢測

嚴格按照說明書要求檢測細胞培養(yǎng)液中IgG、溶菌酶、NO含量及NOS、乳酸脫氫酶的活性。

1.5 IgG和SOD mRNA表達量檢測

用常規(guī)方法提取細胞總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA抽提樣品完整性。所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測。

以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進行常規(guī)PCR反應(yīng)，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

實時熒光定量PCR采用Eva GreenⅠ染料法，反應(yīng)在Bio-RadCFX 96TMReal-TimePCR Systems上進行。反應(yīng)體系為 20μL:SsoFastTMEvaGREESupermix(Bio-Rad，美國)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，加滅菌去離子水至 20 μL。樣品分裝于96孔板(Bio-Rad，美國)中，將可透光蓋(Bio-Rad，美國)蓋緊。反應(yīng)條件為:95℃、10 s;95℃、5 s，59℃、20 s，72℃、15 s，40 個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件處理和方差分析，用Duncan氏法進行多重比較，進行二次回歸分析，試驗結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 LPS對細胞的抑制率

在添加 LPS 使其終濃度為 5、10、15 μg/mL后，觀察細胞形態(tài)，正常細胞(圖1-A)和應(yīng)激細胞(圖1-B)形態(tài)差異不大，但是應(yīng)激細胞間隙有所增大。加入博落回提取物后，細胞繼續(xù)正常生長(圖1-C)，未加入博落回提取物的細胞因過度免疫應(yīng)激而死亡，形態(tài)發(fā)生改變(圖1-D)。不同濃度LPS在不同時間段對細胞的抑制率見表3，本次試驗條件下LPS最適宜濃度和培養(yǎng)時間分別為10 μg/mL 和 12 h。

圖1 LPS和博落回提取物對細胞的形態(tài)的影響Fig.1 Effects of LPS and MC extracts on cell modalities

表3 不同濃度LPS在不同時間段對細胞的抑制率Table3 Inhibition rates of different concentrations of LPS on cells at different time points %

2.2 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞應(yīng)激參數(shù)的影響

由表4可見，經(jīng)LPS刺激，在加入不同濃度博落回提取物之后，細胞培養(yǎng)液中IgG含量極顯著高于對照組和土霉素組(P＜0.01);土霉素組細胞培養(yǎng)液中IgG含量極顯著高于對照組(P＜0.01)。博落回組細胞培養(yǎng)液中溶菌酶含量極顯著高于對照組(P＜0.01);土霉素組與150 ng/mL博落回組溶菌酶含量差異不顯著(P＞0.05)，但是這2組溶菌酶含量顯著高于50和100 ng/mL博落回組(P＜0.05)。博落回組與土霉素組細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性極顯著低于對照組(P＜0.01)，50 ng/mL博落回組細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性顯著低于另外2個博落回組及土霉素組(P＜0.05)。博落回組NO含量及NOS活性極顯著高于對照組和土霉素組(P＜0.01)。

表4 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞應(yīng)激參數(shù)的影響Table4 Effects of MC extracts and oxytetracycline on stress parameters of cells challenged by LPS in pigs

2.3 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞IgG和SOD mRNA表達量的影響

2.3.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物

由圖2可見，其18S、28S條帶清晰，無 DNA污染條帶，無明顯降解條帶。所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測 OD260nm/OD280nm在6～10，純度較高。

圖2 總RNA提取瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of extracted total RNA

由圖3可見，反轉(zhuǎn)錄PCR擴增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、無雜帶，說明引物可以特異性地擴增出目的產(chǎn)物。

2.3.2 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞IgG mRNA表達量的影響

由圖4可見，對正常細胞而言，博落回組和土霉素組IgG mRNA表達量均有極顯著的提高(P＜0.01)，博落回組提高程度極顯著高于土霉素組(P＜0.01)。對應(yīng)激細胞而言，與對照組相比，50 ng/mL博落回組IgG mRNA表達量是對照組的1.91倍(P＜0.01)，100 ng/mL博落回組是對照組的1.85倍(P＜0.01)，150 ng/mL博落回組是對照組的1.82倍(P＜0.01)，但3個博落回組間差異不顯著(P＞0.05)。土霉素組IgG mRNA表達量是對照組的1.65倍(P＜0.01)。博落回組細胞中IgG mRNA表達量均極顯著高于土霉素組(P＜0.01)。應(yīng)激細胞與正常細胞之間比較，應(yīng)激細胞IgG mRNA表達量均高于正常細胞，對照組和100 ng/mL博落回組應(yīng)激細胞與正常細胞差異極顯著(P＜0.01)，50和100 ng/mL博落回組以及土霉素組應(yīng)激細胞與正常細胞差異顯著(P＜0.05)。

圖3 反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of the RT-PCR

圖4 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞IgG mRNA表達量的影響Fig.4 Effects of MC extracts on IgG mRNA expression level of LPS challenged cells in pigs

2.3.3 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞SOD mRNA表達量的影響

由圖5可見，對正常細胞而言，博落回組和土霉素組SOD mRNA表達量均有極顯著的提高(P＜0.01)，土霉素組提高程度極顯著高于博落回組(P＜0.01)。對應(yīng)激細胞而言，50 ng/mL博落回組SOD mRNA表達量是對照組的1.39倍(P＜0.01)，150 ng/mL博落回組是對照組的1.40倍(P＜0.05)，100 ng/mL博落回組是對照組的1.32倍(P＜0.05)。但3個博落回組間差異不顯著(P＞0.05)。土霉素組SOD mRNA表達量是對照組的1.69倍(P＜0.01)。

應(yīng)激細胞與正常細胞之間比較，對照組、50 ng/mL博落回組和土霉素組應(yīng)激細胞SOD mRNA表達量極顯著高于正常細胞(P＜0.01)，100和150 ng/mL博落回組應(yīng)激細胞SOD mRNA表達顯著高于正常細胞(P＜0.05)。

對于應(yīng)激細胞與正常細胞，土霉素組SOD mRNA表達量均極顯著高于對照組及博落回組(P＜0.01)。

圖5 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞SOD mRNA表達量的影響Fig.5 Effects of MC extracts on SOD mRNA expression level of LPS challenged cells in pigs

3 討論

3.1 豬LPS應(yīng)激細胞的應(yīng)激參數(shù)的變化

血液免疫球蛋白濃度是仔豬免疫性能和健康的重要標識之一。IgG具有免疫替代和免疫調(diào)節(jié)的雙重治療效果[8]。人們試圖通過多種途徑來改變仔豬血液IgG濃度，從改善仔豬免疫性能和抗病力。本試驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)液中博落回組IgG含量極顯著高于對照組和土霉素組(P＜0.01)，土霉素組也極顯著高于對照組(P＜0.01)，說明博落回提取物和土霉素均能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生IgG，但博落回提取物增加IgG含量效果顯著優(yōu)于土霉素(P＜0.01)。本試驗結(jié)果表明，添加博落回提取物和土霉素均極顯著提高了溶菌酶含量(P＜0.01)，可能緩解細胞免疫應(yīng)激損傷。乳酸脫氫酶存在于組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，乳酸脫氫酶釋放與細胞膜通透性和完整性有關(guān)，且釋放量與細胞受損程度呈正相關(guān)，故可通過測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性變化評定博落回提取物和土霉素是否損傷及損傷的程度。本試驗結(jié)果表明，博落回組(50、100 ng/mL)及土霉素組細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性均極顯著低于對照組(P＜0.01)，說明對細胞沒有損傷或者損傷不大。有研究表明，通過減少白細胞來促進誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生，能保護腸道免受炎癥損傷[9]。iNOS基因在受到細胞因子或LPS刺激時才表達，iNOS基因表達能催化合成大量的NO。LPS能刺激巨噬細胞產(chǎn)生 NO[10]，簡華剛等[11]報道，LPS 劑量在 0.001 ～0.100 μg/mL時，體外培養(yǎng)大鼠肺微循環(huán)內(nèi)皮細胞分泌NO的量隨LPS劑量的增加而增多，但當(dāng)LPS劑量大于1 μg/mL，其含量不再增加。在本試驗條件下，土霉素組細胞培養(yǎng)液NO含量和NOS活性極顯著高于對照組(P＜0.01)，而不同濃度博落回組的細胞培養(yǎng)液NO含量和NOS活性均極顯著高于對照組和土霉素組(P＜0.01)，結(jié)果說明，博落回提取物與緩解豬細胞應(yīng)激損傷有關(guān)。上述結(jié)果提示，適宜濃度博落回提取物作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑可以改善豬細胞應(yīng)激參數(shù)，其作用機理有待進一步研究。

3.2 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞IgG mRNA的誘導(dǎo)表達

IgG是由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細胞產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，發(fā)揮著抗菌、抗病毒、抗毒素的免疫學(xué)效應(yīng)。IgG分泌細胞在口腔黏膜、胃腸道黏膜及生殖道均有存在[12-13]。IgG是動物自然感染和人工主動免疫后機體產(chǎn)生的主要抗體，是動物機體抗感染的主力。在本試驗中，應(yīng)激細胞中IgG mRNA表達量均高于正常細胞，應(yīng)激細胞中添加博落回對IgG mRNA表達量影響不顯著(P＞0.05)，說明博落回提取物能向上調(diào)節(jié)IgG mRNA表達，土霉素組與對照組相比表達量也有所提高(P＜0.01)。本試驗中，IgG mRNA表達得到了增強，從而能產(chǎn)生更多的IgG抗體，增強體液免疫。

3.3 博落回提取物對豬LPS應(yīng)激細胞SOD mRNA的誘導(dǎo)表達

生物堿具有抗氧化能力，生物堿能清除羥自由基使其能具有抗突變和抗基因毒性的作用[14]。SOD、谷胱甘肽過氧化物酶一起構(gòu)成體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，保護細胞膜及細胞內(nèi)的核酸免受自由基的攻擊。本試驗結(jié)果表明，與對照組比較，添加不同濃度博落回提取物和土霉素均能極顯著提高細胞中SOD mRNA的表達量(P＜0.01)，博落回提取物向上調(diào)節(jié)SOD mRNA表達的能力低于土霉素，而博落回提取物各濃度之間差異不顯著(P ＞0.05)。Slunská 等[15]通過細胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，血根堿、白屈菜黃堿、血根黃堿、白屈菜紅堿不會增加細胞活性氧族產(chǎn)量，并能降低過氧化氫(H2O2)含量引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯示出具有抗氧化作用。本試驗結(jié)果顯示，博落回提取物能誘導(dǎo)SOD mRNA表達，改變SOD活性，結(jié)果可能影響豬應(yīng)激細胞的抗氧化能力。其作用機理仍有待研究。

4 結(jié)論

博落回提取物可提高LPS應(yīng)激細胞IgG、NO和LSZ的含量及NOS活性，提高應(yīng)激細胞和正常細胞IgG和SOD mRNA的表達量，總體效果優(yōu)于土霉素，較好的添加濃度為50～100 ng/mL。

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