何浪君，陳永華，蘇榮葵，蔡 斌，王佳昕，張奧姍，朱虹紅

（中南林業(yè)科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

中國(guó)錳礦資源豐富，分布廣泛，其中以湖南、廣西最為豐富，占全國(guó)總儲(chǔ)量55%[1]。錳是植物必需的生長(zhǎng)元素，適量的錳能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但過量的錳將對(duì)植物產(chǎn)生毒害[2]。錳礦的大量開采，使得錳污染問題日益嚴(yán)重[3]。因此，如何降低錳礦區(qū)污染成為亟須解決的問題[4]。重金屬污染土壤修復(fù)是指使用物理、化學(xué)和生物方法從土壤中去除或固定重金屬，以此降低其遷移性和生物有效性，穩(wěn)定重金屬污染物[5]。生物修復(fù)技術(shù)中的植物修復(fù)是指利用植物來降解、提取或固定重金屬污染物，因其具有低成本、高效益的優(yōu)點(diǎn)，成為主要修復(fù)手段[6]。目前，已知大部分錳超累積植物不但生物量低，修復(fù)效率不高，且?guī)缀鯖]有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，不宜推廣[7]。因此，篩選耐錳性強(qiáng)、生物量大和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的植物，已成為錳礦區(qū)植物修復(fù)的關(guān)鍵。

博落回Macleaya cordata屬多年生草本植物，其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱、耐瘠，并且含有多種可以藥用的博落回提取物生物堿，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[8]。有研究表明博落回對(duì)Mn 有一定的富集能力[9]。然而，在礦渣上種植的植物通常受到礦渣理化性質(zhì)差的限制，使植物成活率低，生物量小[6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)加入改良劑能有效改善礦渣的理化性質(zhì)，降低重金屬的危害[10]。在錳礦渣改良劑篩選與應(yīng)用研究中主要是無機(jī)物與有機(jī)物兩大類，無機(jī)改良劑可以固定礦渣中的錳，其施加過多則存在降低礦渣肥力的可能性，而有機(jī)改良劑可以改善礦渣中的肥力，持續(xù)強(qiáng)化礦渣修復(fù)[11]。有研究表明有機(jī)改良劑蘑菇渣與無機(jī)改良劑凹凸棒進(jìn)行復(fù)合配比，能充分發(fā)揮復(fù)合改良劑中有機(jī)與無機(jī)改良劑各自的優(yōu)勢(shì)，錳礦的植物修復(fù)效果將得到顯著提高[11-12]。因此采用有機(jī)改良劑蘑菇渣與無機(jī)改良劑凹凸棒進(jìn)行復(fù)合配比聯(lián)合多年生草本植物博落回修復(fù)錳礦渣具有十分廣闊的應(yīng)用前景。但是，該復(fù)合改良劑與博落回對(duì)錳礦渣的聯(lián)合修復(fù)機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

因此，本研究以博落回為供試植物、錳礦渣為基質(zhì)、蘑菇渣和凹凸棒為復(fù)合改良劑進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，研究了改良條件下博落回對(duì)錳的耐性、轉(zhuǎn)運(yùn)與富集效應(yīng)，錳在博落回體內(nèi)細(xì)胞的分布情況和化學(xué)形態(tài)，博落回的生理生化、微觀結(jié)構(gòu)與官能團(tuán)，旨在為將博落回應(yīng)用于修復(fù)錳礦污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

博落回采自邵陽隆回縣博落回種植基地，錳礦渣來源于湘潭某錳礦，有機(jī)改良劑蘑菇渣、無機(jī)改良劑凹凸棒、基肥鈣鎂磷肥均購(gòu)置某肥料生產(chǎn)廠家。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基質(zhì)設(shè)為紅壤＋10%（蘑菇渣∶凹凸棒=3∶1）為R、錳礦渣為M、錳礦渣＋10%（蘑菇渣∶凹凸棒=3∶1）為M+，3 種基質(zhì)加入3%的基肥鈣鎂磷肥當(dāng)作肥料，3 種基質(zhì)設(shè)置12 個(gè)重復(fù)。選取植株大小、長(zhǎng)勢(shì)一致的博落回幼苗進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，種植在裝有3 種基質(zhì)的花盆里。2020年5月種植，11月取樣待測(cè)。不同基質(zhì)的基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 3 種基質(zhì)基本理化性質(zhì)?Table 1 Physicochemical characterization of three substrates

1.2.2 樣品的采集與分析

1）博落回預(yù)處理

采集培養(yǎng)6 個(gè)月后的博落回，用超純水清洗，分別剪取博落回的根、莖、葉并稱其鮮質(zhì)量，備用[13]。

2）Mn 含量測(cè)定

將博落回樣品70℃烘干48 h。在微波消解裝置中，用HNO3-HClO4的混合酸（4∶1）消解所有樣品，并使用火焰原子吸收分光光度計(jì)（FAAS，AA-7002，Thermo Fisher Scientific，USA）測(cè)量Mn 濃度。

3）化學(xué)形態(tài)分析

博落回中錳的化學(xué)形態(tài)[14]：一是用80%乙醇（FE）提取無機(jī)形態(tài)；二是H2O（FW）提取有機(jī)形態(tài)；三是用1 mol NaCl（FNaCl）提取的果膠和蛋白質(zhì)形態(tài)；四是用2%HAc（FHAc）提取的未溶解的磷酸鹽形態(tài)；五是用0.6 mol HCl（FHCl）萃取草酸鹽形態(tài)。六是Mn 殘留態(tài)。

4）亞細(xì)胞組分重金屬含量測(cè)定

采用差速離心法分離出博落回細(xì)胞各組分，采用“硝酸-高氯酸”電熱板消解法消解，火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定博落回各組分濃度[15]。

5）生理生化指標(biāo)測(cè)定

用分光光度計(jì)法(UV-5100 紫外可見分光光度計(jì))測(cè)定葉綠素的含量[16]。下列指標(biāo)測(cè)定時(shí)間分為前中后3 期，前期測(cè)定于7月份進(jìn)行，中期測(cè)定于9月份進(jìn)行，后期測(cè)定于11月份進(jìn)行，每次測(cè)量間隔2 個(gè)月。用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[17]；用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白的含量[17]；用氮藍(lán)四唑超氧化物歧化酶(SOD)[17]；用愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)過氧化物酶 (POD)[17]；用紫外吸收法測(cè)過氧化氫酶 (CAT)活性[17]。

6）微觀結(jié)構(gòu)分析

沿葉片主脈兩側(cè)切成長(zhǎng)2～3 mm，寬1 mm的條形小塊，放入2.5%的戊二醛溶液固定。通過掃描透射電子顯微鏡觀察植物根，莖和葉的微觀結(jié)構(gòu)[18]。該檢測(cè)由科學(xué)指南針公司完成。

7）官能團(tuán)分析

用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)測(cè)量官能團(tuán)組成。干燥后的樣品經(jīng)過200 mm 網(wǎng)篩后送科學(xué)指南針公司檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用Excel 2010 處理基本數(shù)據(jù)，用SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.5 制作圖表。耐性指數(shù)（TI）為M 和M+處理下博落回株高、根長(zhǎng)、生物量與R 處理下相應(yīng)數(shù)值的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良錳礦渣對(duì)博落回生長(zhǎng)的影響

不同基質(zhì)處理組的博落回生長(zhǎng)情況如表2所示，與R 處理組相比，M 處理下的博落回生物量、株高、總根長(zhǎng)的數(shù)值均明顯減少，說明Mn 脅迫嚴(yán)重抑制了博落回的生長(zhǎng)。而M+處理下，博落回的生物量為5.96 g，株高為94.10 cm，根長(zhǎng)為518.84 cm，生長(zhǎng)量比起M 處理組明顯提高，甚至略微高于R 處理組，博落回的生長(zhǎng)得到改善。從其耐性指數(shù)可以看出，M+處理組的博落回對(duì)錳礦的耐受性是M 處理的1.77 倍，說明加入復(fù)合改良劑使博落回對(duì)錳礦的耐受性提高。

表2 3 種基質(zhì)處理下博落回的生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of Macleaya cordata under the three treatments

2.2 改良錳礦渣對(duì)博落回葉片葉綠素的影響

表3為3 種基質(zhì)處理下的博落回葉片的葉綠素含量。在M+處理下博落回的葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總量濃度的數(shù)值與M 處理組相比有明顯增加。同時(shí)，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、葉綠素a/b 值均呈現(xiàn)R＞M+＞M 的趨勢(shì)，說明Mn 脅迫下博落回葉片中的葉綠體受到損傷，使葉綠素a/b 降低，光合效率降低，從而加速了博落回葉片的黃化。而添加復(fù)合改良劑后博落回葉片的葉綠素總量、葉綠素a/b 值的增加表明改良后能有效緩解Mn 脅迫對(duì)博落回葉片的損害，減緩了葉片的黃化。

表3 3 種基質(zhì)處理下博落回葉片的葉綠素含量Table 3 Chlorophyll contents of Macleaya cordata leaves under three substrate treatments

2.3 改良錳礦渣對(duì)博落回葉片的生理生化響應(yīng)

觀察圖1可見不同基質(zhì)處理下博落回葉片的可溶性蛋白、MDA、CAT、SOD 和POD 的變化趨勢(shì)。從圖中可以看到，M 處理組中的博落回葉片可溶性蛋白的含量在前、中、后期呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，而在M+處理組的可溶性蛋白含量在中后期則呈現(xiàn)為先升高后下降的變化趨勢(shì)。在前、中、后期，R 處理組與M+處理組中博落回葉片的MDA 均無明顯差異，而隨著時(shí)間的推移，M 處理組的MDA 呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。在前、中、后期，R 處理組與M+處理組中博落回葉片的CAT 活性無明顯變化，而M 處理組隨著時(shí)間的推移CAT 活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在后期比前期降低了33%；3 種基質(zhì)處理組的POD 活性表現(xiàn)出明顯的差異，且隨著時(shí)間的推移，M 與M+處理組的POD 活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。與POD 的變化類似，3 種基質(zhì)處理組的SOD 活性隨著時(shí)間的推移，M 與M+處理組均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在前、中、后期，R 處理組與M+處理組中博落回葉片的MDA 均無顯著性差異，而隨著時(shí)間的推移，M 處理組的MDA 呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。

圖1 3 種基質(zhì)處理下博落回葉片內(nèi)SOD(a)、MDA(b)、CAT(c)、可溶性蛋白(d)和POD(e)的變化Fig.1 The SOD (a),MDA (b),CAT (c),soluble protein contents (d) and POD(e) activities of Macleaya cordata leaves in the three treatments

2.4 錳在博落回根、莖、葉中的亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)分析

2.4.1 錳在博落回根、莖、葉中的亞細(xì)胞分布

從不同基質(zhì)處理下Mn 在博落回根、莖、葉內(nèi)亞細(xì)胞組分分布情況（圖2）中可以看出，博落回根、莖、葉中Mn 主要集中分布在細(xì)胞壁中，其次是可溶性部分，然后是細(xì)胞器組分，表明細(xì)胞壁在博落回耐錳性上起主要作用。與M+處理相比下，在M 處理中，博落回根、莖、葉中細(xì)胞壁組分F1 所占比例明顯降低，由65%、55%、61%分別降至42%、25%、28%。而可溶性組分F3 所占比例則顯著增加，由27%、35%、29%分別增加至38%、55%和54%。細(xì)胞器組分F2 所占比例依次增加10%、9%和8%。

圖2 3 種基質(zhì)處理下博落回根莖葉內(nèi)亞細(xì)胞分布情況Fig.2 Distribution of subcellular components of Mn in roots,stems and leaves of Macleaya cordata seedlings in the three treatments

2.4.2 錳在博落回根、莖、葉中的化學(xué)形態(tài)

從3 種基質(zhì)處理下Mn 在博落回根、莖、葉內(nèi)化學(xué)形態(tài)（圖3）中可以看出，博落回根中的Mn以氯化鈉提取態(tài)為主，與M+處理組相比，M 處理組的氯化鈉提取態(tài)占比增加了14%，而醋酸提取態(tài)占比減少7%。博落回莖中的Mn2+主要呈氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)，在M+處理組中，其占比為51%和18%；而在M 處理組中，氯化鈉提取態(tài)降低至34%，醋酸提取態(tài)增加至32%。在博落回葉中，Mn2+主要為水提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)，與M+處理組相比，M 處理組的水提取態(tài)占比減少了11%。

圖3 3 種基質(zhì)處理下博落回根莖葉內(nèi)化學(xué)形態(tài)分布情況Fig.3 Distribution of chemical forms of Mn in roots,stems and leaves of Macleaya cordata seedlings in the three treatments

2.5 錳脅迫下根、莖、葉微觀結(jié)構(gòu)的變化

觀察3 種基質(zhì)處理下博落回根、莖、葉的透射電鏡（TEM）結(jié)果（圖4）可以看出：在R 處理下，博落回中根、莖、葉內(nèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；博落回葉片中的葉綠體排列整齊，形狀呈現(xiàn)梭形，葉綠體內(nèi)的片層結(jié)構(gòu)排列有序。在M 處理下，博落回的根、莖、葉細(xì)胞受損嚴(yán)重，大部分細(xì)胞器呈解體狀態(tài)流出在細(xì)胞間隙；葉片中的葉綠體形狀膨脹成球形，其中片層排列紊亂；淀粉粒顆粒和線粒體數(shù)量與對(duì)照相比明顯減少，嗜餓顆粒卻變大增多；細(xì)胞壁周圍及細(xì)胞間隙出現(xiàn)大量黑色物質(zhì)，有可能是重金屬沉淀[12]。在M+處理下，博落回根、莖、葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，細(xì)胞器與對(duì)照比相對(duì)減少，葉片中的葉綠體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，淀粉粒卻增多，細(xì)胞間隙有少量黑色物質(zhì)出現(xiàn)。

圖4 3 種基質(zhì)處理下博落回根莖葉的微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Pictures of root,stem,and leaf cells of Macleaya cordata seedlings in the three treatments via TEM

2.6 改良錳礦渣對(duì)博落回組織官能團(tuán)的影響

從不同基質(zhì)處理下Mn 脅迫對(duì)博落回根、莖、葉的傅里葉紅外光譜圖譜變化（圖5）可以看出，圖中的特征峰包括3 422、2 920、1 640、1 035 cm-1這4 處特征峰，其中3 422 cm-1處的吸收峰表示的自由羥基的伸縮振動(dòng)峰主要來自博落回中纖維素、多糖等碳水化合物；2 920 cm-1處的吸收峰表示的是羧基與甲基伸縮振動(dòng)重疊峰，主要來自于博落回中維生素和各種膜與細(xì)胞壁的組織等成分；1 640 cm-1處的吸收峰表示的N－H 酰胺彎曲振動(dòng)峰是博落回中蛋白質(zhì)的特征紅外光譜；1 035 cm-1處的吸收峰表示的是醇、酯基和酚類的C-O 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰[19]。博落回根部發(fā)現(xiàn)，3 422、2 920、1 640、1 035 cm-1這4 處峰值在博落回根中在不同基質(zhì)的峰形無明顯變化。而博落回莖和葉部的官能團(tuán)在3 422、2 920、1 640、1 035 cm-1這4 處的吸收峰發(fā)生明顯偏移。在M 處理下，博落回莖部和葉部3 422 cm-1、2 920 cm-1、1 640 cm-1、1 035 cm-1處的吸收峰與R處理組相比，發(fā)生了明顯偏移，同時(shí)此處吸收峰的峰形變窄，透過率變高；而M+處理組中博落回莖和葉部的這四處吸收峰與M 處理相比峰形均變寬，透過率下降。

圖5 3 種基質(zhì)處理下博落回根、莖、葉官能團(tuán)的影響Fig.5 FTIR analysis of Macleaya cordata roots,stems and leaves in the three treatments

3 結(jié)論與討論

前期課題組篩選出了復(fù)合改良劑（有機(jī)改良劑蘑菇渣和無機(jī)改良劑凹凸棒），可通過無機(jī)改良劑凹凸棒吸附錳礦渣中的重金屬，并結(jié)合有機(jī)改良劑蘑菇渣改善錳礦渣中的肥力，提高植物修復(fù)效果[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加復(fù)合改良劑后的錳礦渣，其孔隙度和有機(jī)質(zhì)濃度數(shù)值相比起錳礦渣明顯增加，這表明復(fù)合改良劑的加入可以使錳礦渣變疏松，提高錳礦渣的滲透性和肥力，為博落回提供更好的生長(zhǎng)條件。M+處理組中的錳的有效態(tài)含量顯著降低，表明改良劑的加入對(duì)礦渣里的錳產(chǎn)生鈍化效果。同時(shí)，M+處理組的博落回的株高、生物量、根長(zhǎng)的數(shù)值與M 處理組相比明顯升高，這表明添加復(fù)合改良劑可以促進(jìn)博落回在錳礦渣中的生長(zhǎng)，減緩錳對(duì)博落回的毒性，提高博落回對(duì)錳的耐受性。

葉綠體中葉綠素含量會(huì)影響博落回的生長(zhǎng)和發(fā)育[20]。在本試驗(yàn)中，M處理下，博落回中葉綠素a，b 的濃度與R 相比明顯降低，這可能是由于Mn 脅迫下博落回葉片中葉綠體或葉綠素酶的活性受到了抑制[21]。同時(shí)，博落回葉片葉綠素a 與葉綠素b 的比值明顯降低，說明博落回葉片葉綠體結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。葉綠素含量下降可能是博落回受到Mn 脅迫后，Mn 結(jié)合葉綠體中蛋白質(zhì)的巰基，抑制了其葉綠素的合成[22]，也可能是Mn 脅迫下活性氧的增加，使博落回中葉綠體的結(jié)構(gòu)與功能遭到損傷[23]。然而，M+處理組博落回葉中的葉綠素a、b 的濃度明顯高于M 處理組，表明改良劑的加入降低了重金屬脅迫下葉綠素的損傷。

MDA 通常用來反映細(xì)胞膜的損傷程度。與M+處理組相比，M 處理組博落回中MDA 含量明顯增加，表明博落回細(xì)胞受到Mn 脅迫出現(xiàn)明顯的膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其細(xì)胞膜受損，細(xì)胞內(nèi)滲透壓失去平衡[21]。而改良劑的加入，可以減少細(xì)胞膜的損傷，緩解細(xì)胞內(nèi)的滲透壓失衡，降低了對(duì)博落回的傷害程度。M+處理組可溶性蛋白的濃度在前、中、后期呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這可能是中期錳脅迫促進(jìn)博落回體內(nèi)糖和蛋白的合成代謝，以滿足生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這也可能是博落回抵抗錳毒害的一種自我保護(hù)機(jī)制[4]。而后期可能由于改良劑加入改善土壤環(huán)境使博落回適應(yīng)了環(huán)境的改變，因此總蛋白下降。在本研究中，礦渣中過量的錳抑制了博落回葉片的生長(zhǎng)，這可能與反應(yīng)氧的種類有關(guān)[24]。Mn 誘導(dǎo)氧化應(yīng)力并增加ROS 量，ROS 主要產(chǎn)生在葉綠體、線粒體；細(xì)胞中過量的ROS 會(huì)引起脂質(zhì)過氧化、膜損傷，影響細(xì)胞代謝和植物的生長(zhǎng)[25]。植物可以通過提高SOD 酶活性激活抗氧化防御系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)Mn 脅迫引起的ROS 含量增加。與M 處理組相比，M+處理組的SOD 的活性明顯增加，表明改良劑的加入提高了SOD 的活性，降低了ROS 的含量，進(jìn)而降低了錳對(duì)植物的毒性。POD 和CAT 可以催化H2O2生成H2O，從而緩解H2O2的增加。在前中后期，在M+和M 處理中CAT 的含量逐漸降低，而在M+和M 處理中，POD 活性高于CAT 活性，表明POD在去除H2O2中起作用。與M處理組相比，M+處理組的POD 的活性明顯增加，表明改良劑的加入提高了POD 的活性，降低了H2O2的含量，減少了錳對(duì)植物的毒性。一般來說，添加改良劑可以調(diào)節(jié)滲透壓平衡和抗氧化酶的活性，以去除由Mn毒性產(chǎn)生的ROS，然后降低脂質(zhì)過氧化作用。這種解毒措施可以保護(hù)原葉細(xì)胞免受毒性，并維持植物生長(zhǎng)的正常生理代謝活動(dòng)。

圖2中發(fā)現(xiàn)，在M+和M 處理組中，博落回根莖葉中的錳主要分布在細(xì)胞壁，這表明博落回通過其細(xì)胞壁的固持作用固定Mn，從而可避免過多的Mn 進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，減輕Mn 對(duì)博落回的毒害作用[26-27]。在M 處理中，在博落回莖、葉的可溶性組分占比分別增加了35%和29%，這表明莖、葉中液泡的區(qū)隔作用明顯增強(qiáng)，這有利于Mn 向葉片轉(zhuǎn)運(yùn)，降低重金屬的毒性。添加復(fù)合改良劑的M+處理組中，Mn 在博落回根、莖、葉細(xì)胞器組分的占比分別下降10%、9%和8%，這表明添加復(fù)合改良劑減輕Mn 脅迫對(duì)博落回細(xì)胞器的損傷，這有利于細(xì)胞進(jìn)行代謝等活動(dòng)，使博落回可以正常生長(zhǎng)。

重金屬在植物體中的形態(tài)是其累積解毒的重要機(jī)制之一[28]。從圖3中看出，Mn 在博落回根莖葉中的形態(tài)主要為氯化鈉提取態(tài)和水提取態(tài)，這表明博落回體內(nèi)的Mn 主要與蛋白質(zhì)螯合、有機(jī)鹽和磷酸鹽沉淀形式存在。在博落回根中，與M 處理組相比，M+處理組的氯化鈉提取態(tài)占比減少了14%，而醋酸提取態(tài)占比增加了7%，說明Mn 向遷移活性弱的提取態(tài)轉(zhuǎn)化，部分限制了Mn 向地上部的遷移，進(jìn)而減輕了Mn 毒害。在博落回葉中，Mn 主要為水提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)，水提取態(tài)Mn 占總錳的34%～39%，去離子水主要提取與水溶性物質(zhì)結(jié)合的部分如水溶性有機(jī)酸鹽，因此博落回葉片中大部分Mn 可能與有機(jī)酸結(jié)合[28]。此前有研究表明有機(jī)酸和重金屬絡(luò)合累積在液泡中，降低重金屬對(duì)植物的毒性[28]。與M 處理組相比，M+處理組的水提取態(tài)占比增加9%，表明改良劑的加入使博落回體中大部分Mn 與有機(jī)酸結(jié)合解毒，毒害減少。

由TEM 觀察到的博落回微觀結(jié)構(gòu)可知：觀察博落回葉片發(fā)現(xiàn)M 處理下博落回細(xì)胞間隙有流出的細(xì)胞器，同時(shí)存在黑色物質(zhì)，推測(cè)該黑色物質(zhì)為重金屬沉淀[13]。在M 處理下，博落回細(xì)胞中液泡可能沉積大量錳金屬沉淀，最終排出細(xì)胞間隙，以防止錳對(duì)博落回細(xì)胞的傷害[13]。M+處理下，博落回的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，葉綠體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，而M 處理的博落回，葉綠體雙層膜破裂或結(jié)構(gòu)消失，表明Mn 脅迫對(duì)博落回葉綠體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害，而改良劑的加入緩解了此損害[30-31]。植物的葉綠體內(nèi)會(huì)含有大量淀粉粒，淀粉粒的降解會(huì)促進(jìn)葉綠體合成有機(jī)溶質(zhì)提供碳骨架去參與滲透調(diào)節(jié)[13]。M+處理下，博落回中葉綠體的淀粉粒的數(shù)量與M 處理相比相對(duì)減少，說明改良劑的加入使博落回對(duì)Mn 脅迫采取了積極的防御措施，促進(jìn)葉綠體中淀粉粒的降解，從而促進(jìn)合成有機(jī)溶質(zhì)以調(diào)節(jié)滲透壓[32-33]。

在本試驗(yàn)中，博落回細(xì)胞壁的固定和液泡的分離可能與2 920 cm-1處的-COOH、-CH3這些功能團(tuán)相關(guān)，這些功能團(tuán)可以結(jié)合博落回中細(xì)胞壁和液泡中的Mn，從而減少M(fèi)n 對(duì)博落回細(xì)胞的毒性[34]。在M+處理后，博落回細(xì)胞細(xì)胞壁和液泡中的氨基酸和羧酸含量增加，從而增強(qiáng)了氨基酸與重金屬的結(jié)合。M 處理后3 422 cm-1處的吸收峰透過率變高，說明此時(shí)錳脅迫破壞了博落回細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Mn 的機(jī)制，導(dǎo)致其細(xì)胞壁的羥基無法吸附結(jié)合Mn，引起峰值升高[35]。而加入改良劑后此機(jī)制未被破壞，反而促進(jìn)博落回的碳水化合物的分泌，從而減少M(fèi)n 對(duì)植物細(xì)胞的損害。研究發(fā)現(xiàn)，1 060 cm-1處吸收峰可能與植物細(xì)胞膜的膜脂過氧化程度相關(guān)，Mn 濃度越高，膜過氧化程度越深，引起峰值升高[35]。從圖5中可以看出M處理下博落回體內(nèi)由于Mn 濃度過高破壞此機(jī)制，使吸光度下降；而M+處理下增加了1 040 cm-1處的硫代基團(tuán)數(shù)量，從而降低膜的過氧化程度。

本研究在細(xì)胞層面對(duì)博落回耐錳的生理生化性質(zhì)及機(jī)理進(jìn)行了討論，下一步可以進(jìn)行組學(xué)分析和耐錳基因檢測(cè)，進(jìn)一步明確博落回的耐錳機(jī)制，為博落回修復(fù)錳礦提供理論依據(jù)。此外，博落回作為經(jīng)濟(jì)作物，在修復(fù)錳礦渣的同時(shí)如何安全高效利用博落回提取物也是今后一個(gè)重要的研究方向。

復(fù)合改良劑（蘑菇渣和凹凸棒）聯(lián)合博落回植物修復(fù)錳礦渣具有很好的效果。博落回是一種能有效穩(wěn)定錳礦渣重金屬元素的草本植物，復(fù)合改良劑的加入提高了錳礦渣的滲透性和肥力，降低錳的毒性，從而促進(jìn)了博落回的生長(zhǎng)。改良條件下，博落回葉片中Mn 對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的損害明顯降低，提高了植物的光合效率；且通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性去除了過量的ROS，調(diào)節(jié)了滲透壓，降低了脂質(zhì)過氧化，從而保護(hù)原蛋白免受Mn 的毒性。與此同時(shí)，改良條件下博落回增加了大量的甲基、羧基基團(tuán)，結(jié)合細(xì)胞壁和液泡的Mn 形成穩(wěn)定化合物，使Mn 在細(xì)胞器的積累減少，降低了Mn 對(duì)博落回的毒性。本研究為復(fù)合改良劑聯(lián)合博落回在錳礦區(qū)生態(tài)修復(fù)中的潛在應(yīng)用提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為植物修復(fù)重金屬污染場(chǎng)地提供了新的視角。