王寶萍 李東風(fēng) 胡方方 徐書雯

目前阿爾茨海默病 （Alzheimer's Disease，AD）病因尚不清楚，可能與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。尸檢發(fā)現(xiàn)AD患者海馬及腦葉區(qū)存在炎性老年斑，說明β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）誘發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)參與AD的發(fā)生發(fā)展。近來國外研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子受體超家族成員CD40與其同源配體CD40L相互作用使Aβ1-42纖維體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?、炎性反應(yīng)擴(kuò)大、加重對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷［1］，國內(nèi)對CD40-CD40L信號介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)與AD的關(guān)系方面研究甚少。目前認(rèn)為Aβ1-42寡聚體對神經(jīng)元的毒性作用最強(qiáng)，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面是否也是最強(qiáng)尚不清楚，本文通過體外建立AD的炎性反應(yīng)模型，探討CD40-CD40L信號在AD炎癥反應(yīng)中的作用，尋找治療AD的可能的靶點，為后續(xù)試驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 新生乳鼠（3 d內(nèi)）購自中山大學(xué)實驗動物中心 （許可證號：SCXK（粵）2009－0011）無菌條件下取出大腦皮質(zhì)，放入預(yù)冷、D-Hanks液清洗2次，小心剝離腦膜和血管，0.125%的胰酶消化，終止后過濾，離心，計數(shù)，接種（DMEM/F12高糖培養(yǎng)基，含1%青霉素、鏈霉素，20%胎牛血清）。24 h后全量換液、之后3 d換液一次，至7～9 d膠質(zhì)細(xì)胞分層。上層細(xì)胞為圓形或橢圓，主要是小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，下層細(xì)胞連成片主要是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶5 min，收集上層細(xì)胞，差速貼壁法進(jìn)一步純化小膠質(zhì)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD11b。

1.1.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 取材接種同前，不同的是第2天更換無血清神經(jīng)元培養(yǎng)基（含1%青霉素、鏈霉素，含 2%B27），3 d一次換液，4～5 d左右形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。

1.2 Aβ1-42寡聚體制作 將人工合成的 Aβ1-42晶體 0.5 mg從－20℃冰箱中取出，六氟異丙醇（HFIP）0.11 mL溶解、重懸。室溫在通風(fēng)櫥內(nèi)使HFIP揮發(fā)，Aβ1-42形成白色肽膜。然后用20 μL二甲基亞楓DMSO溶解，稀釋分裝。4℃、24 h后即為 Aβ1-42 寡聚體［2］，透射電鏡鑒定。

1.3 小膠質(zhì)細(xì)胞炎性模型建立

將分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/孔分別接種到六孔板中，設(shè)立實驗組：采用不同濃度的寡聚體干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果（未給出），本實驗采取濃度為 2.5 μg/mL 的 Aβ1-42 寡聚體單獨及聯(lián)合 2 μg/mL CD40L干預(yù)組、T細(xì)胞參與的適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)物之一γ干擾素（IFN-γ）10 μg/mL聯(lián)合Aβ1-42組，并設(shè)立對照，包括單獨予CD40L干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞及空白對照組，培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后檢測小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放水平及向抗原提呈功能轉(zhuǎn)化情況；將干預(yù)過的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液繼續(xù)培養(yǎng)神經(jīng)元同時將不同干預(yù)條件直接培養(yǎng)神經(jīng)元，分別培養(yǎng)24 h檢測神經(jīng)元乳酸脫氫酶（LDH）的釋放水平來觀察神經(jīng)元的損傷，隨后用 2.5 μg/mL抗 CD40抗體阻斷CD40-CD40L通路后，繼續(xù)觀察以上指標(biāo)的變化。

通過ELLSA法檢測細(xì)胞上清液炎性介質(zhì)TNF-α的釋放，嚴(yán)格按ELLSA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ表達(dá)：收集細(xì)胞，PBS洗2次（1000 r/min，5 min），100 μLPBS 懸浮細(xì)胞，分別加入抗小 鼠FITC-CD40 抗體 （0.5 mg/mL）5 μL 或抗小鼠 FITCCD45 抗體（0.5 mg/mL）5 μL，抗小鼠 PE-MHCⅡ抗體（0.2 mg/mL）5 μL，避光室溫孵育30 min，PBS 洗2 次（1 000 r/min，5 min），400 μL PBS 懸浮細(xì)胞，上機(jī)即流式細(xì)胞儀檢測。

小膠質(zhì)細(xì)胞被干預(yù)后的炎性上清液進(jìn)一步干預(yù)神經(jīng)元后，用ELLSA法檢測神經(jīng)元上清液LDH的釋放情況，嚴(yán)格按LDH試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 研究資料均采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 小膠質(zhì)細(xì)胞胞體圓形或橢圓形；流式細(xì)胞術(shù)鑒定純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞，表面CD11b的陽性率在95%以上（見圖1）。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD11b流式鑒定

2.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)4～5 d后，神經(jīng)元開始形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞為棕褐色，陽性率為90%以上（見圖2）。

圖2 神經(jīng)元免疫細(xì)胞化學(xué)染色

2.3 Aβ1-42寡聚體的制作 制作成功的 Aβ42寡聚體在透射電鏡下顯示為圓形或橢圓形的立體結(jié)構(gòu)（見圖 3）。

圖3 Aβ1-42寡聚體透射電鏡下檢測

2.4 CD40L對AD炎癥細(xì)胞模型影響及神經(jīng)元損傷情況 與對照組相比，Aβ1-42寡聚體為2.5 μg/mL干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞24 h時，發(fā)現(xiàn)上清液中TNF-α釋放明顯增加，加入CD40L或IFN-γ后炎性介質(zhì)增加更明顯，加入抗CD40抗體后，發(fā)現(xiàn)上清TNF-α 釋放減少，與 Aβ1-42＋CD40L 組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性上清液培養(yǎng)神經(jīng)元后，Aβ1-42＋CD40L組與Aβ1-42組相比 LDH 的釋放增加，Aβ1-42＋CD40L＋抗 CD40抗體組較Aβ1-42＋CD40L組減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。用Aβ1-42等直接培養(yǎng)神經(jīng)元，與炎癥上清液培養(yǎng)神經(jīng)元比較，LDH釋放明顯少 （見表1）。加入CD40L后小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ分子共表達(dá)陽性率比單獨Aβ1-42干預(yù)組高（見圖4）；加入抗CD40抗體后，二者的共表達(dá)陽性率較Aβ1-42單獨及聯(lián)合CD40L干預(yù)組下降（見圖4）。

圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞表面CD40及MHCⅡ表達(dá)

3 討論

CD40L是主要表達(dá)于活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞及血小板，而CD40表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等。CD40L在一定條件下可與CD40相結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。AD患者血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）受到破壞，血液中活化的 CD4＋T細(xì)胞可以透過BBB進(jìn)入腦組織參與免疫反應(yīng)。

為研究CD40L在Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及對神經(jīng)元的影響，我們在體外建立AD炎癥反應(yīng)模型，并用炎癥上清液培養(yǎng)神經(jīng)元，模擬AD患者體內(nèi)炎性微環(huán)境的改變對神經(jīng)元的影響。結(jié)果表明：Aβ1-42寡聚體聯(lián)合CD40L較單獨干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞更能促進(jìn)TNF-α釋放。提示在促炎方面CD40L與Aβ1-42具有協(xié)同作用。我們繼續(xù)用抗CD40抗體通過阻斷CD40-CD40L通路，可以減輕Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元的損傷。研究發(fā)現(xiàn)在TgAPPsw/CD40L基因缺陷鼠及體外阻斷CD40-CD40L通路可以降低Aβ1-42 纖維體誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)［3－4］。這與我們的研究基本一致。此外，CD40L還可以促進(jìn)Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)CD40及MHCII分子明顯增加，促進(jìn)其向抗原提呈功能的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而加重對神經(jīng)元的損傷。為進(jìn)一步證實該結(jié)論，我們通過用T細(xì)胞的炎癥產(chǎn)物IFN-γ干預(yù)Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其與CD40L聯(lián)合Aβ1-42產(chǎn)生的致炎效應(yīng)相當(dāng)。有研究［5］用米諾環(huán)素下調(diào)T細(xì)胞活化產(chǎn)生的CD40L，可以減少細(xì)胞毒性T細(xì)胞對產(chǎn)生Aβ1-42的神經(jīng)元的損傷。說明CD40及CD40L對Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面均具有重要作用。此外，Aβ1-42及CD40L直接或炎癥上清液干預(yù)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)后者對神經(jīng)元的損傷更重。阻斷CD40-CD40L信號通路，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元損傷減輕。CD40L可能通過腫瘤壞子因子受體相關(guān)因子 （tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）進(jìn)一步活化核因子 κB（NF-κB）信號通路［6］或通過轉(zhuǎn)錄因子活化金屬蛋白激酶［7］發(fā)揮作用。

表1 不同干預(yù)組小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α水平、直接培養(yǎng)神經(jīng)元及炎性上清液培養(yǎng)神經(jīng)元后LDH的釋放水平

Aβ1-42可以誘導(dǎo)CD40-CD40L調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫及適應(yīng)性免疫活化［8］，加重神經(jīng)元損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞表面有不同的受體，在不同的微環(huán)境條件下，Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)毒性作用，而CD40L則是促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性的重要介質(zhì)，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞向抗原提呈功能轉(zhuǎn)化及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元，因此，早期阻斷CD40-CD40L通路有望成為治療AD的潛在靶點。

［1］Townsend KP，Town T，Mori T，et al.CD40 signalingregulates innate and adaptive activation ofmicroglia in response to amyloid beta-peptide［J］.Eur J Immunol，2005，35（3）：901－910.

［2］ 王建秀，王德生，段淑榮，等.原子力顯微鏡觀察不同Aβ聚集狀態(tài)的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（1）：33－35.

［3］Todd Roach J，Volmar CH，Dwivedi S，et al.Behavioral effects of CD40-CD40L pathway disruption in aged PSAPP mice ［J］.Brain Res，2004，10（15）：161－168.

［4］Laporte V，Ait Ghezala G，Volmar CH，et al.CD40 deficiency mitigates Alzheimer's disease pathology in transgenic mouse models［J］.J Neuroinflammation，2006，3（3）：342－343.

［5］Giuliani F，Hader W，Yong VW，et al.Minocycline attenuates T cell and microglia activity to impair cytokine production in T cell-microglia interaction［J］.J Leukoc Biol，2005，78（1）：135－143.

［6］Ait-ghezala G，Abdullah L，Volmar CH，et al.Diagnostic utility of APOE，soluble CD40，CD40L，and Abeta1-40 levels in plasma in Alzheimer's disease［J］.Cytokine，2008，44 （2）：283－287.

［7］Volmar CH，Ait-Ghezala G，F(xiàn)rieling J，et al.CD40/CD40L interaction induces Aβ production and increasesγ-secretase activity independently of tumor necrosis factor receptor associated factor（TRAF） signaling.Exp Cell Res，2009，315（13）：2265－2274.

［8］Townsend KP，Town T，Mori T，et al.CD40 signalingregulates innate and adaptive activation ofmicroglia in response to amyloid beta-peptide［J］.Eur J Immunol，2005，35（3）：901－910.