陳云鵬 張弩 丁之明 夏之柏

正常細(xì)胞分裂過(guò)程的任何偏差會(huì)造成中心體擴(kuò)增、染色體異常分離以及非整倍體的產(chǎn)生，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而誘發(fā)腫瘤［1］。近年來(lái)，一種新的參與有絲分裂的絲氨酸蘇氨酸激酶家族——Aurora家族逐漸被認(rèn)識(shí)，其分為3類(lèi)：Aurora-A、Aurora-B 和 Aurora-C，其中 Aurora-A 最受關(guān)注［2］。研究發(fā)現(xiàn)Aurora A過(guò)表達(dá)不但使某些腫瘤如卵巢癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移率明顯提高，而且與患者預(yù)后直接相關(guān)［3－4］。敲低 Aurora A 在喉癌細(xì)胞的表達(dá)可使其對(duì)順鉑的敏感性增加［5］。我們先前的研究也發(fā)現(xiàn)Aurora A在膠質(zhì)瘤中存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，本文研究敲低Aurora A基因聯(lián)合替莫唑胺（temozolomide，TMZ）治療后細(xì)胞增殖變化，探討其作為腫瘤基因治療新靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 U87細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；抗Aurora A抗體購(gòu)自美國(guó)Bethyl公司；抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的抗兔IgG和抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德；替莫唑胺由美國(guó)Schering-Plough公司提供；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；pshRNA Lentivector質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、基于人免疫缺陷病毒骨架的慢病毒包裝系統(tǒng) （Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit）購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；中量質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；人膽囊收縮素八肽（CCK8）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含青霉素、鏈霉素，置37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建Aurora A shRNA質(zhì)粒載體（廣州復(fù)能基因公司協(xié)助構(gòu)建）。按說(shuō)明書(shū)用Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit慢病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒感染。慢病毒感染24 h后對(duì)樣品進(jìn)行換液處理；48 h后用熒光顯微鏡檢查GFP表達(dá)；96 h開(kāi)始添加濃度為7.5 μg/L的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染了Aurora A shRNA和空載體的U87細(xì)胞是否有熒光。細(xì)胞分未轉(zhuǎn)染組（U87）、 空載體組 （U87-GFP） 及轉(zhuǎn)染組（U87-shRNA）

1.4 RT-PCR檢測(cè)Aurora A mRNA表達(dá) 提取3組細(xì)胞總RNA，按Promega試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。Aurora A上游5′-AATCTGGAGGCAAGGTTCGACTG-3′，下游 5′-TGGGAGATAAGT GGTTAAGGAGG-3′，GAPDH為內(nèi)參照。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線(xiàn)下檢測(cè)并拍照。

1.5 Western blot檢測(cè) Aurora A蛋白表達(dá) 提取3組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度；蛋白樣品（每泳道50 μg）行 7.5%SDS PAGE 電泳，100 mV 轉(zhuǎn)膜。牛奶封閉，加入 Aurora A 抗體（1∶200）和 β-actin 抗體（1∶500）4℃過(guò)夜，次日加入 HRP 標(biāo)記二抗（1∶5000），37℃1 h，洗膜后ECL發(fā)光，X膠片曝光、顯影。

1.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性 替莫唑胺用DMSO配制成濃度為 100 mmol/L的溶液，－20℃保存，臨用時(shí)用全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未轉(zhuǎn)染組、空載體組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度 2 × 104/mL，置 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入濃度依次為10、25、50、100、200 μmol/L 的 TMZ，每孔加 100 μL 并設(shè)置空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（二甲基亞砜），每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。另取未轉(zhuǎn)染組、空載體組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，加入 50 μmol/L TMZ分別作用24、48、72 h。完成處理后每孔加入CCK8試劑10 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm的吸光度OD值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝（1－加藥組OD平均值/對(duì)照組OD平均值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。做對(duì)數(shù)曲線(xiàn)算出IC50值。

1.7 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未轉(zhuǎn)染組、空載體組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用TMZ同前處理。處理完成后，將細(xì)胞收集于流式管中，PBS洗滌，70%冰乙醇固定，再用PBS洗滌2次，每管加入預(yù)先配制好的PI染液l mL，室溫避光5 h，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 Aurora A轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞的鑒定 熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染組和空載體組細(xì)胞帶綠色熒光蛋白，表明轉(zhuǎn)染成功（圖1）。用ImageJ軟件分析條帶灰度。RT-PCR結(jié)果灰度值分別為：未轉(zhuǎn)染組 （31023±926）、 空載體組 （30124±1074）、 轉(zhuǎn)染組 （896±172），各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2159.63，P＜0.001），兩兩比較顯示轉(zhuǎn)染組灰度值低于其他兩組（P ＜ 0.001）；Western blot結(jié)果灰度值分別為：未轉(zhuǎn)染組 （39556±2306）、 空載體組 （39348±2738）、轉(zhuǎn)染組（574±96），各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝589.36，P ＜ 0.001），兩兩比較顯示轉(zhuǎn)染組灰度值低于其他兩組（P＜0.001）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于空載體組及未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染組的Aurora A mRNA和蛋白表達(dá)均降低（圖2、3）。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的比較 表1顯示陰性對(duì)照組（二甲基亞砜）內(nèi)，未轉(zhuǎn)染組、空載體組、轉(zhuǎn)染組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝0.35，P ＞ 0.05）。表1、圖 4A 表明在一定TMZ濃度范圍內(nèi)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著濃度的升高而增加，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。經(jīng)不同濃度的替莫唑胺作用不同時(shí)間后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的TMZ劑量反應(yīng)曲線(xiàn)左移。經(jīng)直線(xiàn)回歸方程計(jì)算，未轉(zhuǎn)染組、空載體組、轉(zhuǎn)染組的半數(shù)有效抑制濃度（IC50） 分別為：（43.38±2.15）μmol/L、（43.76±1.52）μmol/L、（22.20±2.34）μmol/L，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝184.06，P ＜ 0.001），兩兩比較顯示轉(zhuǎn)染組半數(shù)有效抑制濃度（IC50）低于其他兩組（P ＜ 0.001）。用 50 μmol/L TMZ 處理各組細(xì)胞，相同時(shí)間點(diǎn)各組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較顯示，相同時(shí)間點(diǎn)下轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞抑制均高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組（P ＜ 0.01）（表2、圖 4B）。

圖1 轉(zhuǎn)染組和空載體組細(xì)胞（×200，熒光顯微鏡）。A：轉(zhuǎn)染組（明場(chǎng)）；B：轉(zhuǎn)染組（熒光）；C：空載體組（明場(chǎng)）；D：空載體組（熒光）

圖2 轉(zhuǎn)染前后U87細(xì)胞Aurora A mRNA表達(dá)（RT-PCR）

圖3 轉(zhuǎn)染前后U87細(xì)胞Aurora A蛋白表達(dá)（Western blot）

圖4 替莫唑胺對(duì)未轉(zhuǎn)染組、空載體組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖的影響

表1 不同濃度替莫唑胺作用于未轉(zhuǎn)染組、空載體組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞72 h的生長(zhǎng)抑制率

表2 未轉(zhuǎn)染組、空載體組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在50 μmol/L替莫唑胺作用下不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

表3 未轉(zhuǎn)染組、空載體組與轉(zhuǎn)染組接受50 μmol/L替莫唑胺及對(duì)照（DMSO）處理72 h細(xì)胞周期變化（%）

2.3 細(xì)胞凋亡的比較 表3顯示兩種不同處理下未轉(zhuǎn)染組、空載體組和轉(zhuǎn)染組各組間G2/M期比例的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較顯示兩種不同處理下轉(zhuǎn)染組G2/M期比例均高于其他兩組 （P＜0.01）。敲低Aurora A聯(lián)合TMZ比單獨(dú)敲低Aurora A或者單獨(dú) TMZ 處理 G2/M 期阻滯明顯（P ＜ 0.01）。

3 討論

Aurora A位于重要的癌基因區(qū)域20q13，在有絲分裂期定位于中心體和紡錘體，在中心體復(fù)制、分離、成熟的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Aurora A高表達(dá)通過(guò)干擾紡錘體組裝的檢測(cè)點(diǎn)，引起胞質(zhì)分裂中止，最終出現(xiàn)中心體擴(kuò)增形成非整倍體細(xì)胞。少數(shù)非整倍體細(xì)胞生存下來(lái)，其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)高于鄰近的正常細(xì)胞，導(dǎo)致形成腫瘤的可能性大大增加［6］。

我們發(fā)現(xiàn)Aurora A基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)，敲低其表達(dá)后，細(xì)胞增殖明顯降低。Cammareri等［7］報(bào)道，直腸癌高表達(dá)Aurora A基因，沉默其表達(dá)后細(xì)胞增殖也明顯下降，對(duì)5-FU的敏感性也明顯增加。Lehman NL等［8］發(fā)現(xiàn)Aurora A過(guò)表達(dá)可促進(jìn)喉鱗狀上皮癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，敲低Aurora A基因表達(dá)可使喉鱗狀上皮癌對(duì)順鉑的敏感性增加。我們發(fā)現(xiàn)敲低Aurora A基因不但使替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的IC50明顯降低，而且也可使細(xì)胞經(jīng)較低濃度替莫唑胺作用后增殖活性顯著下降。綜上所述，敲低Aurora A基因表達(dá)不但能使多種腫瘤增殖活性下降，而且能增加腫瘤對(duì)化療的敏感性。

Aurora A基因表達(dá)下調(diào)增加腫瘤細(xì)胞化療敏感性的機(jī)理尚不清楚。我們的研究證實(shí)敲低Aurora A可使腫瘤細(xì)胞的G2/M比例增加，協(xié)同TMZ處理腫瘤細(xì)胞G2/M比例進(jìn)一步增加，但凋亡并無(wú)增加。Marumoto等［9］在非霍奇金淋巴瘤中發(fā)現(xiàn) Aurora A過(guò)表達(dá)破壞細(xì)胞G2/M檢查點(diǎn)的功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期無(wú)法阻滯于G2/M期；并使細(xì)胞在DNA受損情況下繼續(xù)進(jìn)行分裂，產(chǎn)生惡性轉(zhuǎn)化。故敲低Aurora A的表達(dá)，可能是通過(guò)恢復(fù)細(xì)胞G2/M檢查點(diǎn)的功能，使其得以發(fā)揮自身的監(jiān)控作用，產(chǎn)生G2/M期阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。Lee S 等［10］認(rèn)為 Aurora A可對(duì)p53的315位絲氨酸磷酸化，導(dǎo)致其通過(guò)泛素化途徑降解。敲低Aurora A的表達(dá)可能恢復(fù)p53功能，產(chǎn)生G2/M期阻滯，達(dá)到抑制增殖的作用。p53功能降低或缺失，bcl-2表達(dá)水平過(guò)高，以及表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)過(guò)高可干擾細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)，降低對(duì)化療藥物的敏感性［11］。誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬是替莫唑胺的重要作用。由于自噬的特點(diǎn)，藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬會(huì)出現(xiàn)兩種不同的結(jié)果：一是保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受放化療損傷，另一種是啟動(dòng)細(xì)胞主動(dòng)性的Ⅱ型細(xì)胞死亡程序。自噬早期抑制劑抑制替莫唑胺誘導(dǎo)自噬的同時(shí)可削弱其抗腫瘤效應(yīng)，而自噬晚期抑制劑可誘導(dǎo)凋亡增加替莫唑胺抗腫瘤效應(yīng)［12］。

Zhang J等［13］發(fā)現(xiàn)在替莫唑胺耐藥細(xì)胞株中U373VR細(xì)胞中MGMT蛋白上調(diào)；SNB19VR細(xì)胞中的hMSH6表達(dá)缺失造成的MMR損傷。體外和臨床試驗(yàn)研究均證實(shí)腫瘤的烷化劑抵抗性是由MGMT過(guò)表達(dá)或MMR缺陷介導(dǎo)的。而Aurora A的上調(diào)都可以使MGMT過(guò)表達(dá)或MMR缺陷介導(dǎo)，使腫瘤獲得對(duì)替莫唑胺導(dǎo)致的損傷耐受或修復(fù)的能力。因此敲低Aurora A除可延長(zhǎng)細(xì)胞有絲分裂G2期外還有下調(diào)MGMT修復(fù)MMR的功能，從而增強(qiáng)替莫唑胺的抗腫瘤作用。Aurora A的敲低不僅其本身就具有抗腫瘤作用，而且能增強(qiáng)腫瘤對(duì)替莫唑胺等化療藥物的敏感性，因此Aurora A基因?qū)⑹俏磥?lái)膠質(zhì)瘤基因治療和聯(lián)合化療的重要靶基因。

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