唐兆華 廖正步 支興剛 謝延風(fēng) 石全紅 何朝暉 詹彥

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷、缺血性腦卒中等眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病共同的病理過(guò)程。顱腦疾病常常伴發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧則是引起腦水腫的最重要病理基礎(chǔ)之一。促紅細(xì)胞生成素是血液系統(tǒng)主要的造血因子。近年國(guó)內(nèi)外及本課題組前期的體外研究發(fā)現(xiàn)，重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinanthuman erythropoietin，rhEPO)在神經(jīng)系統(tǒng)中具有減輕創(chuàng)傷性腦水腫等重要的神經(jīng)保護(hù)功能[1-4]。新近研究顯示水通道蛋白 4(aquaporin4，AQP4)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的水通道蛋白，在腦內(nèi)水電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要作用[5-6]，而且已有最新研究表明rhEPO可以調(diào)節(jié)AQP介導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性的改變[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中占絕大多數(shù)比例的神經(jīng)細(xì)胞，它的水腫會(huì)造成嚴(yán)重的腦損害[7]。所以，本研究旨在觀察rhEPO預(yù)處理對(duì)氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫及其AQP4表達(dá)的影響，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 新生2 d內(nèi)的SD大鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)50只，胎牛血清(美國(guó)Gibco)，無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基(中國(guó) 鈕因華信)，神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(美國(guó)Sigma)，乳酸脫氫酶試劑盒(美國(guó) Hyclone)，RT-PCR試劑盒(美國(guó) Ferments)，AQP4 多克隆抗體(美國(guó) Santa Cruz)。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)[8]取新生2 d內(nèi)的SD大鼠，取大腦皮層剪碎并消化后，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃，20%O2的孵箱1 h，將細(xì)胞懸液換至有多聚賴氨酸涂底的培養(yǎng)瓶，隔2 d換液，7 d后 37℃，180 r／min 水平振蕩 10 h，換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿至95%瓶底后傳代，待培養(yǎng)至第三代時(shí)，用特異性GFAP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞行免疫熒光染色，鑒定成熟、純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.3 氧糖剝奪模型的建立[9]去掉星形膠質(zhì)細(xì)胞的含血清的DMEM／F12培養(yǎng)基，用PBS沖洗 2次，換為未添加血清的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于1%O2的孵箱(美國(guó) Thermo)行5 h時(shí)長(zhǎng)的氧糖剝奪，此后再給細(xì)胞換回含血清的DMEM／F12培養(yǎng)基，并于20%O2的孵箱行復(fù)氧培養(yǎng)，至0.5 h、2 h、8 h、24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)進(jìn)行觀察及實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為3個(gè)組：①正常組，未行氧糖剝奪及rhEPO預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞；②模型組，未經(jīng)rhEPO預(yù)處理，直接行氧糖剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞；③rhEPO預(yù)處理組，先在星形膠質(zhì)細(xì)胞的正常培養(yǎng)基中加入1IU／mL rhEPO

作用2 h后，再對(duì)其進(jìn)行氧糖剝奪(在0.1、1和10 IU／mL三種濃度的預(yù)實(shí)驗(yàn)中1IU／mL rhEPO保護(hù)作用最強(qiáng))。每個(gè)分組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有3～5個(gè)隨機(jī)抽樣的獨(dú)立樣本。

1.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察 用光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica)直接觀察氧糖剝奪并復(fù)氧培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測(cè)定 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞分別在氧糖剝奪后復(fù)氧培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行LDH活性測(cè)定，取每孔細(xì)胞培養(yǎng)液約0.3 mL，按照乳酸脫氫酶試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)試樣品中LDH的活性，LDH漏出率＝培養(yǎng)基LDH×100%／(胞漿LDH+培養(yǎng)基 LDH)。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行PCR。AQP4引物： 上游 5′CCTACAGAACCAAGGCGTAA3′，下游5′TCCCTGGAAATGACTGAGAA3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 261 bp；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物：上游 5′ACCTCCAACACCCCAGCCATG3′，下游 5′CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 691 bp。反應(yīng)體系25 μL，58℃退火 45 s，共循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，長(zhǎng)波紫外燈下觀測(cè)照相。用Quantity One軟件分析電泳條帶平均光密度值，AQP4／β-actin積分A值為AQP4 mRNA表達(dá)水平。

1.8 Western Blot法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白的表達(dá) 分別消化各組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解20 min，測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，沸水變性5min。每孔加入40 μg蛋白樣品電泳，用PDVF膜轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗AQP4(1∶300)，4℃孵育過(guò)夜，加入 HRP 標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，ECL顯影，GAPDH作為內(nèi)對(duì)照參數(shù)。用Quantity One軟件分析熒光條帶平均光密度值，AQP4／β-actin積分 A值為 AQP4蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，組間比較均采用單因素方差分析，兩兩比較均采用Turkey法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 星型膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)原代成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞成片生長(zhǎng)，形態(tài)較扁而大，呈多邊不規(guī)則形，有細(xì)長(zhǎng)突起，細(xì)胞間連接緊密(圖1 A)。對(duì)培養(yǎng)成功的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，用特異性GFAP抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，熒光顯微鏡下見(jiàn)熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例＞98%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求(圖1 B)。

2.2 光學(xué)顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變 模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞在5 h氧糖剝奪后復(fù)氧培養(yǎng)至0.5 h時(shí)，出現(xiàn)邊緣皺縮，折光率增高，胞體略增大，胞內(nèi)形成較多顆粒樣物質(zhì)，至2 h時(shí)形態(tài)變化加重，細(xì)胞明顯腫脹變圓，折光率明顯增高，突起增粗縮短，少量細(xì)胞呈凝固性壞死，8 h時(shí)腫脹的細(xì)胞稍有緩解，部分壞死細(xì)胞已脫落懸浮，細(xì)胞數(shù)量減少，至24 h時(shí)腫脹雖有所緩解，但較正常細(xì)胞仍有明顯腫脹(圖2 A～D)。

rhEPO預(yù)處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞在5 h氧糖剝奪后復(fù)氧培養(yǎng)至0.5 h時(shí)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量顆粒樣物質(zhì)，至2 h時(shí)細(xì)胞邊緣皺縮，輪廓加強(qiáng)，僅部分胞體及足突輕度腫脹，折光率增高，但形態(tài)變化明顯輕于模型組，至8 h時(shí)細(xì)胞腫脹減輕，未見(jiàn)明顯壞死細(xì)胞，24 h時(shí)大部分細(xì)胞基本恢復(fù)扁平、多邊形，有細(xì)長(zhǎng)突起的正常形態(tài)(圖2 E～H)。

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率變化 LDH漏出率在5 h時(shí)長(zhǎng)的氧糖剝奪后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，呈不斷增高趨勢(shì)(24 h時(shí)：F＝80.45，P＜0.01)。 與正常組相比，模型組LDH漏出率氧糖剝奪后24 h時(shí)增加最多(P＜0.01)；與模型組相比，rhEPO預(yù)處理組LDH漏出率在5 h時(shí)長(zhǎng)的氧糖剝奪后24 h時(shí)的增高趨勢(shì)有明顯降低(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.4 RT-PCR法檢測(cè) AQP4 mRNA的表達(dá)變化正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定量的AQP4 mRNA表達(dá)；與正常組比較，模型組細(xì)胞AQP4 mRNA在5 h氧糖剝奪并復(fù)氧培養(yǎng)至0.5 h時(shí)表達(dá)有所下降(P ＝ 0.041)，2 h時(shí)回升(P ＝0.381)，至 8 h時(shí)明顯高于正常并達(dá)最高值(P＜0.01)，24 h時(shí)有所下降，但仍明顯高于正常水平(P＜0.01)；與模型組比較，rhEPO預(yù)處理組AQP4 mRNA在氧糖剝奪后的表達(dá)變化趨勢(shì)與模型組相似，但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平均有明顯降低(8 h時(shí)：P＜0.001)，見(jiàn)圖 3，表2。

圖1 原代成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞(A光學(xué)顯微鏡)及其鑒定(B細(xì)胞免疫熒光)

圖2 rhEPO預(yù)處理對(duì)5 h氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響。

2.5 Western Blot法檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)變化正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定量的AQP4蛋白表達(dá)；與正常組相比，模型組細(xì)胞AQP4蛋白在5 h氧糖剝奪并復(fù)氧培養(yǎng)至 0.5 h時(shí)表達(dá)先下降(P＝0.021)，2 h 時(shí)回升(P ＝ 0.527)，至 8 h 時(shí)明顯高于正常組(P ＜ 0.01)，24 h 時(shí)達(dá)最高值(P ＜ 0.01)；rhEPO預(yù)處理組AQP4蛋白在5 h氧糖剝奪后的表達(dá)變化趨勢(shì)與模型組相似，但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平均有明顯降低(24 h 時(shí)：P ＜ 0.01)，見(jiàn)圖3，表2。

3 討論

近二十年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)EPO及其受體廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[10]，在病理?xiàng)l件下發(fā)揮了各種重要的神經(jīng)保護(hù)功能。最新研究表明rhEPO可以明顯減輕大鼠顱腦創(chuàng)傷后的腦水腫[2]和大鼠凍傷模型中的血管源性腦水腫[11]，并且能夠很好地保護(hù)血腦屏障的完整性[12]。Gunnarson等在體外低滲模型及興奮性氨基酸模型中發(fā)現(xiàn)，rhEPO能明顯降低野生原代星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性的上調(diào)，但在AQP4敲出的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中則無(wú)上述作用[4]。目前，rhEPO減輕腦水腫的具體途徑及機(jī)制目前都尚不清楚。所以，本研究觀察rhEPO預(yù)處理后對(duì)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫模型中AQP4表達(dá)的影響，探討EPO減輕腦水腫是否是通過(guò)調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

體外氧糖剝奪模型可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起明顯腫脹，能模擬體內(nèi)顱腦創(chuàng)傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中星形膠質(zhì)細(xì)胞因缺血再灌注損傷引起細(xì)胞毒性腦水腫這一重要病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞在5 h氧糖剝奪后，細(xì)胞逐漸腫脹，2 h至8 h時(shí)達(dá)到腫脹高峰，至24 h時(shí)腫脹仍未消退，期間有大量細(xì)胞壞死，LDH活性的不斷增高也印證了星形膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷的表現(xiàn)。而在氧糖剝奪前加入rhEPO預(yù)處理，能使細(xì)胞的腫脹明顯減輕，且在復(fù)氧后24 h時(shí)，腫脹的細(xì)胞形態(tài)已基本恢復(fù)正常，壞死細(xì)胞明顯減少，LDH活性增高的程度也同樣明顯降低。上述結(jié)果表明rhEPO預(yù)處理能夠明顯減輕5 h氧糖剝奪引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。

表1 rhEPO預(yù)處理對(duì)5 h氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率的影響

圖3 rhEPO預(yù)處理對(duì)5 h氧糖剝奪后各時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

表2 rhEPO預(yù)處理對(duì)5 h氧糖剝奪后AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

AQP4是腦內(nèi)主要的水通道蛋白，在國(guó)內(nèi)外研究及本課題組的前期研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，它與腦水腫的形成及轉(zhuǎn)歸均密切相關(guān)。Papadopoulos等人在細(xì)胞毒性腦水腫模型發(fā)現(xiàn)中，AQP4敲除小鼠的腦水腫程度明顯輕于野生小鼠[13]。Thrane等人發(fā)現(xiàn)AQP4敲除鼠可減輕低滲液引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹[14]。而Yang等人發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)AQP4小鼠中，其細(xì)胞毒性腦水腫則較野生型小鼠更加嚴(yán)重[15]。由此可見(jiàn)，AQP4表達(dá)水平的高低與細(xì)胞毒性腦水腫的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

在5 h氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重水腫的過(guò)程中，AQP4 mRNA和蛋白的表達(dá)量在短時(shí)下降后，呈上升趨勢(shì)。而在加入rhEPO預(yù)處理后，AQP4 mRNA和蛋白的表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較模型組均明顯降低，細(xì)胞水腫也明顯減輕。AQP4在氧糖剝奪后短時(shí)下降可能是細(xì)胞保護(hù)性下調(diào)，或者因氧糖剝奪導(dǎo)致的細(xì)胞能量障礙，使其蛋白合成能力降低所致。而經(jīng)rhEPO預(yù)處理后，氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)水平明顯降低，由此可以阻止細(xì)胞水腫過(guò)程中胞外水分異常過(guò)多的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到減輕5 h氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的作用。

EPO調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)，減輕氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的作用，為臨床創(chuàng)傷性腦水腫、顱內(nèi)瘤周腦水腫等腦水腫的治療提供了新的思路。最新研究表明，EPO可通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路的活化減輕創(chuàng)傷性腦水腫，起到神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的作用[16]，但其具體分子機(jī)制研究有待于我們進(jìn)一步的研究來(lái)探討。

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