郭偉云 張紅星 趙晶媛 宋學(xué)勤 李文強(qiáng) 郝偉 呂路線

精神分裂癥是一種慢性復(fù)雜性精神疾病，全球終身患病率達(dá)到1.0%[1]。腦結(jié)構(gòu)和動物實驗的結(jié)果均顯示神經(jīng)發(fā)育異?？赡苁蔷穹至寻Y的病因之一，精神分裂癥的分子遺傳學(xué)研究也證實了幾個可重復(fù)的染色體定位和易感基因[2-3]，結(jié)果提示多個神經(jīng)發(fā)育通路上的基因變異參與了精神分裂癥的發(fā)展[4]。

RELN定位在人類染色體7q22.1，編碼：388.42 Da的胞外基質(zhì)絲氨酸蛋白酶。RELN影響神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)和小腦的遷移，調(diào)控神經(jīng)元和神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞的微管功能[5-6]。RELN在大腦、海馬和小腦等腦結(jié)構(gòu)片層結(jié)構(gòu)形成中扮演關(guān)鍵角色[7]。腦形態(tài)和工作記憶能力與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析也報道了RELN與精神分裂癥的認(rèn)知功能損傷等有關(guān)[8-9]，Shifman等證實了 RELN的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP) 位點rs7341475在猶太人和英格蘭人群中與女性精神分裂癥患者相關(guān)聯(lián)[10]。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)在RELN基因的rs12705169位點與漢族女性精神分裂癥患者關(guān)聯(lián)[11]。本研究采用病例對照研究分析RELN基因多態(tài)性與中國漢族精神分裂癥是否存在關(guān)聯(lián)，采用另一樣本群體對前期的研究結(jié)果進(jìn)行重復(fù)和驗證。

1 對象與方法

1.1 研究對象 為來自2009年至2011年在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-Ⅳ)偏執(zhí)型精神分裂癥的診斷，由兩名經(jīng)過一致性培訓(xùn)的主治醫(yī)師進(jìn)行軸I障礙定式臨床檢查(Structured Clinical Interview for DSM-Ⅳ-TR Axis I Disorders-Patient Edition SCID-I／P)共同診斷；②年齡 17～46歲。 排除標(biāo)準(zhǔn)：患有重大軀體疾病(糖尿病、高血壓、腫瘤等)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和其它精神疾病者。共326例患者，男女各半，年齡 17～46歲，平均(26.54±5.24)歲。

正常對照組來自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的職工、新鄉(xiāng)市各醫(yī)院的健康體檢者及新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院在校大學(xué)生。經(jīng)精神科篩查本人無精神疾病史且父母二系三代中無精神障礙史及自殺史者，常規(guī)體檢顯示為健康狀態(tài)，排除標(biāo)準(zhǔn)：童年或嬰幼兒期出現(xiàn)過高熱驚厥的；幼年被收養(yǎng)或生活于單親家庭中，家族史不祥者；母孕期階段有宮內(nèi)窘迫等不良發(fā)育史或其出生階段有產(chǎn)傷史者；有重大軀體疾病如糖尿病、高血壓、腫瘤等。篩選出與患者組年齡和性別相匹配的334名正常對照，男女各半，年齡 18～42歲，平均為(26.37±6.30)歲。上述研究對象均為豫北地區(qū)的中國漢族無關(guān)個體。

本研究研究計劃經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過，由研究對象或法定代理人簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 所有受試者均采集外周靜脈血，EDTA抗凝低溫凍存待用。采用天根生化科技RelaxGene血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 RELN 基因 rs12705169、rs11764507 和rs17157643位點基因分型 采用ABI7500型熒光定量PCR儀對每個SNPs位點進(jìn)行基因型的測定，PCR條件為：95℃ 10 min，然后 92℃ 15 s、60℃ 60 s 循環(huán)40次，Taqman-MGB基因分型試劑購自美國ABI公司。對基因分型進(jìn)行質(zhì)量控制，隨機(jī)抽取50例樣本委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司采用ABI 3730基因測序儀對3個SNPs位點所在區(qū)域進(jìn)行DNA直接測序，分析其基因型。

1.2.3 統(tǒng)計分析 關(guān)聯(lián)分析、Hardy-weinberg平衡的分析采用HaploviewV4.1軟件進(jìn)行卡方檢驗。相對風(fēng)險率以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示。 定量資料采用方差分析。其它統(tǒng)計學(xué)顯著性水平設(shè)為雙側(cè)P值 ＜0.05。多重校正采用Bonferroni校正。基因型與性別相互作用采用SNPStats在線分析工 具 分 析[12]。 采 用 Genetic Power Calculator 計 算統(tǒng)計學(xué)效率。

2 結(jié)果

2.1 基因分型質(zhì)量控制 熒光定量基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果符合率99.25%。樣本尺寸326能提供0.81的統(tǒng)計學(xué)效力發(fā)現(xiàn)對基因型分布的微效影響(r＝0.1～0.23)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果 3個SNPs中有兩個SNPs基因型分布在全部樣本中符合Hardy-Weinberg平衡(rs17157643：χ2＝0.759，P＝0.38；rs11764507：χ2＝0.013，P＝0.907)，rs12705169在患者組中不符合Hardy-Weinberg平衡，但在對照組中分布符合仍進(jìn)入后續(xù)分析。

2.3 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 患者組和對照組之間rs12705169的基因型(χ2＝24.61，P＜0.01)和等位基因頻率(χ2＝21.26，P＜0.01)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，患者組的A等位基因頻率高于對照組(OR ＝1.73，95%CI＝1.39～2.11)。 兩組rs11764507的基因型分布差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝ 7.96，P ＝ 0.019)。 但應(yīng)用 Bonferroni校正后只有rs12705169仍然保持在基因型和等位基因分布上的陽性關(guān)聯(lián)(均P＝0.001)。見表1。LD分析顯示未發(fā)現(xiàn)3個SNPs構(gòu)成的單體型與精神分裂癥關(guān)聯(lián)。

2.4 不同性別關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 按性別分層后在女性患者和對照中rs12705169的基因型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，rs12705169和rs17157643等位基因頻率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在男性患者和對照中3個SNP基因型分布差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)行Bonferroni校正后只有rs12705169的基因型和等位基因頻率(P＝0.001)在女性中與精神分裂癥保持陽性關(guān)聯(lián)(表1)。以女性最大等位基因純合子在病例和對照之間的分布為參照，計算其比值比及95%可信區(qū)間，結(jié)果顯示rs12705169的基因型和性別之間存在相互作用?；蛐虯A(OR＝0.43，95%CI＝0.18～0.45) 和AC(OR＝0.43，95%CI＝0.29～0.63)在女性患者中均表現(xiàn)為保護(hù)因素。global檢驗和一元線性Trend檢驗顯示基因型與性別之間存在相互作用(均P＜0.01)。

3 討論

最近的幾項研究支持RELN與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)[9-15]。 Ekelund 等[13]在芬蘭人群利用受累同胞對和家系確定染色體7q22區(qū)域與精神分裂癥連鎖，RELN位于這個區(qū)域。隨后也是在芬蘭人群中Wedenoja等[9]發(fā)現(xiàn)在RELN上的幾個微衛(wèi)星和SNPs與精神分裂癥的語言功能、視覺記憶功能等存在關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果在他們進(jìn)一步的工作中得到重復(fù)[14]。Shifman 等[10]報道的女性特異性關(guān)聯(lián)位點rs7341475在徳裔猶太人中也得以重復(fù)[15]。本課題組前期研究中rs7341475與精神分裂癥無關(guān)聯(lián)[11]，這也與Shifman等[10]在漢族人群里的研究一致。本課題組前期研究中在漢族精神分裂癥患者及其對照中對RELN基因37個SNP位點進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示位點 rs12705169、rs11764507和 rs17157643與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)，本研究利用同一地區(qū)的另一群體對前期工作進(jìn)行重復(fù)，考察的3個位點分析結(jié)果與前一階段結(jié)果一致，佐證了前期結(jié)果的可靠性。

將本研究的對象按性別分層后單位點分析顯示僅在女性中有2個關(guān)聯(lián)位點，這一結(jié)果與Shifman 的報道類似[10]。

精神分裂癥患者在臨床因素上存在性別差異的報道并不少見，在癥狀、前驅(qū)行為和起病年齡等多方面均有表現(xiàn)。在遺傳水平上存在性別差異也有不少報道。研究顯示在大腦皮質(zhì)第一層神經(jīng)元RELN女性精神分裂癥患者高于男性，在白質(zhì)間隙只有男性患者的表達(dá)降低[16]。一般認(rèn)為精神分裂癥的性別差異與雌激素有關(guān)，RELN在腦發(fā)育過程中可能存在與雌激素的相互作用從而使其在精神分裂癥患者中表現(xiàn)出女性特異性關(guān)聯(lián)。雖然精神分裂癥性別差異的確切的機(jī)制尚不明了，本研究為精神分裂癥在遺傳易感性上的性別差異提供了又一證據(jù)。

表1 兩組rs12705169、rs17157643、rs11764507基因型和等位基因頻率的比較

目前為止仍未見到有關(guān)rs12705169與精神分裂癥關(guān)聯(lián)的其它報道，這也與精神分裂癥其它候選基因的研究情況類似，原因可能有以下幾點。首先就是種族的不同；其次是與精神分裂癥的異質(zhì)性有關(guān)，此前的一些研究沒有報道如診斷亞型之類的臨床背景，精神分裂癥基于不同癥狀表現(xiàn)在DSM-Ⅳ中被分為5個亞型，本研究限定在偏執(zhí)型精神分裂癥，一定程度上避免了表型異質(zhì)性，潛在的提高了發(fā)現(xiàn)基因與疾病關(guān)聯(lián)的效率；第三種可能性就是人群層化問題，以往的研究均沒有切實的證據(jù)證實研究群體不存在人群層化，但他們的研究對象多從一個較廣的地理區(qū)域收集而來，本研究對象均來自新鄉(xiāng)市周邊地區(qū)，人群層化分析這一客觀手段也顯示所有個體來自于一個遺傳人群。

本研究為成功重復(fù)和驗證了前期研究成果為RELN作為精神分裂癥的易感基因提供了證據(jù)，這一陽性關(guān)聯(lián)需要更大樣本量和重復(fù)研究在不同群體里驗證。

感謝 研究者向參與研究的病人和他的家庭以及健康志愿者表示衷心感謝，同時感謝為本研究收集樣本做出貢獻(xiàn)的新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的醫(yī)護(hù)人員。

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