張國華 徐杰 吳達(dá)榮 陶恩祥

研究表明，散發(fā)性帕金森病(Parkinson’s disease，PD)可能與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用有關(guān)[1-2]，其中環(huán)境因素占了十分重要的地位。 魚藤酮作為一種環(huán)境毒素，和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四 氫 吡 啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)一樣能誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元(dopamine，DA)受損、缺失，十分適合用于 PD 動物模型的制作[3]。

在PD治療方面，近年來被廣泛開展的外科治療近期療效不錯[4]，但只是治標(biāo)不治本，遠(yuǎn)期療效尚不確切。然而，如何阻止DA神經(jīng)元凋亡則被看作是根治PD的新方向。據(jù)報道，利福平除具有抗結(jié)核等作用外，還具有抗氧化應(yīng)激及抗神經(jīng)元凋亡的作用，從而提示利福平可能具有治療PD的作用[5]。我們之前的研究已證實，利福平在體外和體內(nèi)均具有保護(hù)DA神經(jīng)元的作用[6-7]，但利福平在體內(nèi)保護(hù)神經(jīng)元的作用是否通過對抗細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)卻還沒明確。

本實驗是在上述的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，通過魚藤酮誘導(dǎo) Sprague-Dawley(SD)大鼠出現(xiàn) DA神經(jīng)元的凋亡，從而觀察利福平在活體內(nèi)的抗神經(jīng)元凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性SD大鼠72只(清潔級，中山大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量250～300 g。將大鼠隨機(jī)分成五組，正常對照組及利福平(MD公司)對照組各12只，魚藤酮(Sigma公司)組、利福平治療組及利福平預(yù)防組各16只。正常對照組、利福平對照組及魚藤酮組分別每天給予背部皮下注射葵花油(Sigma 公司)1 mL／(kg·d)、利福平灌胃及背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液；利福平治療組在給予魚藤酮1周后開始同時給予魚藤酮和利福平；利福平預(yù)防組在給予魚藤酮的前3 d每天先給予利福平灌胃，然后每天同時給予魚藤酮和利福平。以上各組總的處理時間均為3周；魚藤酮在葵花油乳化液中的濃度為1.5 mg／mL，給藥劑量為1.5 mg／(kg·d)； 利福平在生理鹽水中的濃度為 5 mg／mL，給藥劑量為 30 mg／(kg·d)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠處死及標(biāo)本采集 于第3周末分別處死各組大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注冰鹽水100 mL，持續(xù)灌注冰4%多聚甲醛-PBS100 mL，斷頭取腦，4%多聚甲醛-PBS固定過夜，冠狀切斷包含黑質(zhì)的腦組織(前囟尾側(cè)4.6～6.2 mm)，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.2.2 原位末端標(biāo)記法(Tunel)(R＆D 公司)檢測凋亡 中腦石蠟切片脫蠟回水，NeuroPore室溫處理后去DNA酶水漂洗，陽性對照組用TACS核酸酶孵育30 min，室溫下抑制5 min，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)標(biāo)記緩沖液5 min，標(biāo)記反應(yīng)混和液37℃孵育1 h，TdT終止緩沖液室溫下5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，鏈霉親和素-辣根過氧化物(DAB)酶室溫下10 min復(fù)染，脫色，封片，光鏡下觀察黑質(zhì)區(qū)凋亡情況。

1.2.3 黑質(zhì) Bax、Bcl-2 和 Caspase3 免疫組化檢測切片脫蠟回水后微波熱修復(fù)抗原，辣根過氧化物酶(HRP)阻斷劑阻斷30 min，分別4℃孵育兔抗鼠Caspase-3 多克隆抗體(Chemicon 公司)(1∶100)、兔抗鼠 Bax 多克隆抗體(Santa Cruz公司)(1∶100)、兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)(1∶100)過夜，HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗(Boster公司)(1∶100)室溫孵育2 h，DAB顯色，復(fù)染，脫水、透明、烘干，中性樹膠封片后鏡下觀察。

1.2.4 圖像分析 經(jīng) Tunel及 Bax、Bcl-2和 Caspase-3免疫組化染色后的切片(每組中5個大鼠同一層面的中腦黑質(zhì)切片)在Imagepro-Plus5.1系統(tǒng)下，每張切片取3個不同的視野進(jìn)行Tunel及Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的計算，每一張Tunel染色切片放大400倍進(jìn)行觀察和分析，每一張免疫組化染色切片放大200倍進(jìn)行觀察和分析，陽性細(xì)胞計數(shù)的單位是個／mm2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 Tunel及 Bax、Bcl-2和 Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均采用(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，5組大鼠以上4種陽性細(xì)胞數(shù)均數(shù)的比較均采用單因素方差分析，處理組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠中腦黑質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)目的比較 如表1、圖1所示，Tunel檢測結(jié)果顯示，兩對照組的大鼠黑質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；與兩對照組相比，其余3組的大鼠黑質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增多，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，而黑質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)在其余3組間的兩兩比較也均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。

表1 Tunel及 Bax、Bcl-2、Caspase3 陽性細(xì)胞數(shù)(400 ×，200 × )(個 ／mm2)

圖1 大鼠中腦黑質(zhì)凋亡細(xì)胞(Tunel，胞質(zhì)呈棕褐色為陽性)(400×)

圖2 大鼠中腦黑質(zhì)Bax、Bcl-2和Caspase3陽性細(xì)胞(DAB染色，胞質(zhì)呈棕褐色為陽性)(200×)

2.2 大鼠中腦黑質(zhì) Bax、Bcl-2和 Caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)的比較 如表1、圖2所示，兩對照組的大鼠黑質(zhì)的Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；與兩對照組相比，其余3組的大鼠黑質(zhì)Bax及Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多而Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)均明顯減少，且3組中的這3個指標(biāo)均與兩對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，而這3個指標(biāo)在其余3組中的兩兩比較也均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。

3 討論

近年來，隨著神經(jīng)生化技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)PD的發(fā)生與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系。研究表明，各種因素導(dǎo)致的PD最終都經(jīng)過黑質(zhì)DA神經(jīng)元大量凋亡這一共同通路[8]。線粒體、氧化應(yīng)激及α-synuclein是整個凋亡過程中的關(guān)鍵因素。在PD患者黑質(zhì)DA神經(jīng)元內(nèi)，線粒體功能異常和氧化應(yīng)激可使α-synuclein發(fā)生異常聚集，而α-synuclein的異常聚集反過來影響線粒體的功能，從而形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和PD的發(fā)生[9]。

在蛋白水平上，與PD細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的是Bcl-2蛋白家族的Bcl-2(抑細(xì)胞凋亡)和Bax(促細(xì)胞凋亡)兩種蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的比值對凋亡的發(fā)生起到重要調(diào)節(jié)作用[10]。同時，在PD患者黑質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中caspase級聯(lián)反應(yīng)是必不可少的環(huán)節(jié)[11]。上述發(fā)現(xiàn)提示，黑質(zhì)DA神經(jīng)元凋亡的核心環(huán)節(jié)可能是各種因素的作用下導(dǎo)致Bcl-2和Bax的比例下降及Caspase-3的激活并最終引起細(xì)胞凋亡。

魚藤酮是一種人類容易少量長期接觸的環(huán)境毒素，其可直接通過血腦屏障抑制腦組織的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性[12]。由于DA神經(jīng)元對能量障礙特別敏感，因此低劑量的魚藤酮在不影響其他部位細(xì)胞線粒體功能的情況下卻可引起DA神經(jīng)元的凋亡[13]。另有研究顯示，魚藤酮最終通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的比例并激活caspase來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

有學(xué)者提出，利福平之所以同時具有透過血腦屏障抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，是由于其結(jié)構(gòu)式中有一個連有脂肪鏈的萘氫醌環(huán)[5]。利福平經(jīng)口服后在大鼠腦中濃度可達(dá)到血藥濃度的 13%[15]，能有效作用于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]。 而本課題組已通過實驗發(fā)現(xiàn)，利福平可在體外對抗MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[6]，但此作用在活體身上卻還沒得到證實。

在本研究中，我們選擇了魚藤酮來誘導(dǎo)SD大鼠出現(xiàn)中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元的大量凋亡，并同時應(yīng)用利福平經(jīng)胃給藥以抗凋亡，通過檢測凋亡細(xì)胞數(shù)及Bax、Bcl-2和Caspase-3的免疫活性變化以觀察利福平是否具有抑制魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①低劑量慢性暴露于魚藤酮后，大鼠黑質(zhì)的凋亡細(xì)胞明顯增多，而同時給予利福平灌胃的大鼠黑質(zhì)凋亡細(xì)胞比僅給予魚藤酮的大鼠明顯減少；②低劑量慢性暴露于魚藤酮后，大鼠黑質(zhì)部位Bax、Caspase-3表達(dá)增多而Bcl-2表達(dá)減少，而同時給予利福平灌胃的大鼠黑質(zhì)的上述變化均有所減輕；③預(yù)防性使用利福平所起的抗凋亡作用較治療性使用利福平更顯著。因此，我們得出以下結(jié)論：①魚藤酮在活體內(nèi)是通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑來引起DA神經(jīng)元的大量丟失的，而利福平則在活體內(nèi)具有對抗魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用；②魚藤酮在活體內(nèi)通過下調(diào)Bcl-2和Bax的比值、激活caspase通路來誘導(dǎo)DA神經(jīng)元凋亡發(fā)生的，而利福平在活體內(nèi)可通過上調(diào)Bcl-2和Bax的比值、抑制caspase通路來實現(xiàn)抗魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用；③應(yīng)用利福平的起始時間越早、持續(xù)時間越長，對抗細(xì)胞凋亡的作用越明顯。

總的來說，本研究不但成功地模擬了環(huán)境毒素(線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ)在活體內(nèi)誘發(fā)大量DA神經(jīng)元發(fā)生凋亡的過程，驗證了這類毒素引起細(xì)胞凋亡發(fā)生的通路，而且進(jìn)一步證實了利福平具有抑制環(huán)境毒素誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元凋亡的作用，闡明了其抗凋亡作用的實現(xiàn)途徑。這些重要發(fā)現(xiàn)使利福平應(yīng)用于治療人類PD的想法由空想變成可能，為在PD的治療上獲得重大突破邁出了堅實的一步。

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