李衛(wèi)東

(天津商業(yè)大學(xué)體育衛(wèi)生部，天津 300134)

興奮劑檢測方法的研究進(jìn)展

李衛(wèi)東

(天津商業(yè)大學(xué)體育衛(wèi)生部，天津 300134)

目前常用的興奮劑檢測方法有氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、化學(xué)發(fā)光免疫分析法和電化學(xué)法等。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)仍是興奮劑檢測的主要方法，氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法以及不斷衍生的各類質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可被用于檢測大部分興奮劑。免疫分析法主要被應(yīng)用于類固醇類興奮劑和激素類興奮劑的檢測。電化學(xué)法只能針對具有特定電活性的物質(zhì)進(jìn)行檢測?；蚺d奮劑的檢測仍處在初級階段。

興奮劑檢測;色譜/質(zhì)譜聯(lián)用;免疫分析;基因興奮劑

1964年，國際運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)會(huì)的國際興奮劑會(huì)議將興奮劑的概念定義為:參加競賽的運(yùn)動(dòng)員使用任何異體物質(zhì)，或以不正常的量和不正常的進(jìn)入機(jī)體的途徑使用生理物質(zhì)，試圖人為地以不正當(dāng)方式提高其競賽成績的行為［1］。眾所周知，使用興奮劑對運(yùn)動(dòng)員的身體和心理都有嚴(yán)重的傷害。在體育競技比賽中使用興奮劑也是一種不道德行為，不僅不符合誠實(shí)和公平競爭的體育道德，也是對運(yùn)動(dòng)員誓言的背叛，和對奧林匹克憲章的褻瀆。因此對興奮劑的檢測研究始終是反興奮劑工作的重點(diǎn)之一。

檢測儀器的發(fā)展，特別是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的長足進(jìn)步，使得復(fù)雜生物基質(zhì)中的微量成分可以被精確測定，并極大促進(jìn)了興奮劑檢測手段的進(jìn)步。目前，興奮劑檢測的主要方法有氣相色譜［2］、高效液相色譜［3］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［4］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［5］、免疫分析法［6］、流動(dòng)注射電化學(xué)發(fā)光［7］、高效毛細(xì)管電泳［8］、毛細(xì)管電泳-離子阱質(zhì)譜［9］等方法。本文對目前主流的興奮劑檢測方法進(jìn)行了綜述。

1 色譜-質(zhì)譜法

色譜儀具有高效的分離能力，質(zhì)譜儀可以通過直接測定物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)與電荷的比值準(zhǔn)確快速地對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜儀的高效分離作用與質(zhì)譜儀對未知樣品的準(zhǔn)確鑒別能力相結(jié)合，是色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)三種現(xiàn)代化技術(shù)緊密結(jié)合的產(chǎn)物。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要分為氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法，可被用于檢測大部分興奮劑，包括蛋白同化制劑、肽類激素、b22激動(dòng)劑、有抗雌激素作用的制劑、利尿劑和其他掩蔽劑、刺激劑、麻醉劑、大麻(酚)類、糖皮質(zhì)類固醇等［10］。

1.1 氣相色譜-質(zhì)譜法

由于從氣相色譜柱分離后的樣品呈氣態(tài)，流動(dòng)相也是氣體，與質(zhì)譜儀的進(jìn)樣要求相匹配，因此氣相色譜儀和質(zhì)譜儀最容易實(shí)現(xiàn)聯(lián)用。氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法綜合了氣相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了各自的缺陷，具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可同時(shí)完成待測組分的分離和鑒定，特別適用于多組分混合物中未知組分的定性和定量分析，判斷化合物的分子結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確測定化合物的分子量。

1972年慕尼黑奧運(yùn)會(huì)興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室首次使用GC-MS聯(lián)用儀對興奮劑進(jìn)行檢測［11］。之后，GC-MS聯(lián)用技術(shù)有了長足進(jìn)步，特別是毛細(xì)管氣相色譜柱的使用，使GC-MS技術(shù)的分離效果和進(jìn)樣量有了極大改善。1984年洛杉磯奧運(yùn)會(huì)的1 510份尿樣全部使用GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行類固醇類興奮劑的篩選和確證［11］。

20世紀(jì)90年代，高分辨質(zhì)譜(high resolution mass spectrometry，HRMS)技術(shù)通過測量離子的精確質(zhì)量，從而避開其它具有相同整數(shù)質(zhì)量離子的干擾，顯著降低了化學(xué)噪聲，提高了測量的信噪比。采用HRMS技術(shù)檢測殘留激素類物質(zhì)成為歐洲共同體認(rèn)可的方法［12］。Sch?nzer等［13］通過檢測6 700份運(yùn)動(dòng)員尿樣中的蛋白同化雄性激素類固醇(anabolic androgenic steroids，AAS)含量，對比研究了GC-HRMS法和GC-MS法的檢測能力。采用GC-MS法僅檢出41份陽性尿樣，而GC-HRMS法檢出了116份陽性尿樣。這是由于其中75份陽性尿樣屬低濃度樣品，用GCMS法無法檢出，采用GC-HRMS才可檢出。因此，1993年在德國Stuttgart舉行的世界田徑錦標(biāo)賽，首次將GC-HRMS法用于興奮劑檢測［14］。1996年亞特蘭大奧運(yùn)會(huì)也首次采用GC-HRMS法對興奮劑進(jìn)行檢測，并首次報(bào)告檢出1種新的免疫刺激劑布羅曼坦(bromantan)［11］。

2000年悉尼奧運(yùn)會(huì)首次引進(jìn)了氣相色譜-燃燒-同位素比質(zhì)譜(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometer，GC-C-IRMS)法，主要用于檢測內(nèi)源性類固醇制劑。這種質(zhì)譜技術(shù)廣泛用于地質(zhì)、石油等行業(yè)，用于測量目標(biāo)化合物中C13和C12的比值，其原理見圖1［11］。

圖1 氣相色譜-燃燒-同位素比質(zhì)譜原理示意圖

目標(biāo)化合物經(jīng)由氣相色譜分離后進(jìn)入氧化爐，所有碳?xì)浠衔锎呋趸蒀O2和H2O，通過冷阱或膜除去水，CO2進(jìn)入質(zhì)譜儀，由法拉第杯檢測質(zhì)量數(shù)44、45和46的信號，然后計(jì)算得出該化合物C13和C12的比值。由于人體自身合成與分泌的內(nèi)源性類固醇激素C13和C12的比值與制藥工業(yè)制備的類固醇制劑的同位素比不同，所以通過該法可以檢測運(yùn)動(dòng)員是否使用了類固醇制劑。但是該方法也存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低等缺點(diǎn)，因此，目前該方法不用于初篩，只用于可疑陽性樣本的確定。

1.2 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)聯(lián)用技術(shù)始于20世紀(jì)70年代，1992年巴塞羅那奧運(yùn)會(huì)上使用LC/MS聯(lián)用儀很方便地檢出刺激劑美沙卡伯(mesocarb)的代謝物，顯示了LC-MS聯(lián)用的優(yōu)越性，但當(dāng)時(shí)的接口和離子化技術(shù)限制了LC-MS聯(lián)用技術(shù)在常規(guī)檢測中的廣泛應(yīng)用［11］。

隨著20世紀(jì)80年代中后期大氣壓電離技術(shù)(atmosphere pressure ionization，API)的成熟，LC-MS聯(lián)用技術(shù)得以迅速發(fā)展［15］。LC-MS的API技術(shù)是一種軟電離方式，通過調(diào)節(jié)離子源電壓，可以控制離子的斷裂，獲取結(jié)構(gòu)信息，大大拓寬了LC-MS的分析范圍，可被用來分析蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸等生物大分子。在興奮劑檢測領(lǐng)域，LC-MS法不僅可以檢測刺激劑等小分子興奮劑，也可以對肽類激素和蛋白質(zhì)等大分子興奮劑進(jìn)行檢測［16-19］。

針對刺激劑利他林及其主要代謝物利他林酸，陸江海等［20］利用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了檢測它們在人尿中含量的方法。他們將尿樣中的藥物經(jīng)反相C18固相萃取柱凈化、氮?dú)獯抵粮?，以甲睪為內(nèi)標(biāo)，用流動(dòng)相溶解后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。研究表明，該方法的最低檢出限為5 μg· L–1，利他林和利他林酸的回收率分別為80.6%和68.4%，批內(nèi)和批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.0%，滿足國際反興奮劑機(jī)構(gòu)對其最低檢測能力500 μg·L–1的要求。

在體內(nèi)主要以代謝產(chǎn)物形式存在的禁用藥物，如合成類固醇、刺激劑、麻醉劑和B2阻斷劑等，LC-MS可以通過測定葡萄糖醛酸甙或硫酸酯結(jié)合物來確定藥物的代謝情況，從而實(shí)現(xiàn)對這些藥物的定量測定［21，22］。另外，一些采用GC-MS法檢測結(jié)果不理想的甾體化合物、糖皮質(zhì)激素等也可采用LC-MS檢測，并且檢出限可以達(dá)到世界反興奮劑委員會(huì)的最低檢出限水平［23］。2004年雅典奧運(yùn)會(huì)就采用了液相色譜-離子阱質(zhì)譜技術(shù)分析檢測糖皮質(zhì)激素［11］。

對于肽類激素和蛋白質(zhì)檢測通常采用的是免疫檢測方法，但隨著LC-MS技術(shù)的成熟，樣品前處理技術(shù)以及儀器的選擇性和特異性的不斷提高，不少基于LC-MS-MS的檢測方法也被用于檢測肽類激素和蛋白質(zhì)［18，24-26］。蛋白質(zhì)通過酶解后產(chǎn)生多個(gè)肽段，經(jīng)液相色譜分離后用串聯(lián)質(zhì)譜獲得肽的質(zhì)量譜，從而對肽段進(jìn)行鑒別和測定。通過蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)檢索，得出蛋白質(zhì)序列信息，從而實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的快速高靈敏度的鑒別和測定［18］。

目前，由于LC-MS技術(shù)的不同電離源對不同類型物質(zhì)的電離條件各不相同，受液相色譜條件影響大，裂解信息少，往往需要測定多級裂解的譜圖才能達(dá)到鑒別的目的。因此譜圖解析技術(shù)的不成熟和較高的儀器成本，導(dǎo)致LC-MS技術(shù)的普及性還不及GC-MS技術(shù)。

2 免疫分析法

免疫分析法是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)對禁用藥物的檢測，具有快速、高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)。該方法主要包括酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CIA)和放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，主要被應(yīng)用于類固醇類興奮劑和激素類興奮劑的檢測。

睪酮是常見的內(nèi)源性類固醇類興奮劑，其代謝產(chǎn)物主要有脫氫睪酮和甲基脫氫睪酮等。對運(yùn)動(dòng)員血清睪酮的檢測大多采用放射免疫法，但該方法自動(dòng)化程度低，不適用于快速檢測，又有放射污染。因此目前更多的研究集中于采用酶聯(lián)免疫吸附法對睪酮及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析［27］。Kramer等［28］將脫氫勃地酮半抗原和甲基脫氫勃地酮半抗原與匙孔帽貝血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanine，KLH)和牛血清白蛋白偶聯(lián)，然后通過腹部注射入免疫小鼠和兔子，產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆和多克隆抗體。利用酶聯(lián)免疫分析法測定17β-脫氫勃地酮和甲基脫氫勃地酮，檢出限分別達(dá)到0.13 μg/L和0.54 μg/L，滿足國際反興奮劑機(jī)構(gòu)的測定要求。Salvador等［29］制備了四氫孕三烯酮(tetrahydrogestrinone，THG)的多克隆抗體，與牛血清白蛋白偶聯(lián)后建立了對THG的競爭性酶聯(lián)免疫分析方法，在緩沖溶液中檢出限可以達(dá)到(0.045±0.015) μg/L，對經(jīng)過簡單預(yù)處理的實(shí)際尿樣檢出限可達(dá)到(0.25±0.14)μg/L，盲樣分析表明，該方法具有較好的精確度。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)屬于單鏈酸性糖蛋白，能促進(jìn)骨髓紅細(xì)胞的生成，提高機(jī)體血紅蛋白的濃度，改善機(jī)體的攜氧能力和耐力，對肌體的有氧工作能力有明顯的促進(jìn)作用，可減少肌體的運(yùn)動(dòng)性疲勞，故而有人在比賽中濫用，以提高運(yùn)動(dòng)成績［30］。1990年，國際奧委會(huì)就將重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human EPO，rhEPO)及其衍生產(chǎn)品列為興奮劑，但因rhEPO與內(nèi)源性EPO的蛋白部分完全一致，藥物代謝動(dòng)力學(xué)的半衰期僅3至10h，尿中排泄?jié)舛葮O低，而且體內(nèi)EPO含量的個(gè)體差異很大，個(gè)體本身EPO值也會(huì)因缺氧、貧血、pH值、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、晝夜節(jié)律的變化而變化，因此一直缺乏行之有效的檢測方法［31-33］。直至2000年悉尼奧運(yùn)會(huì)才對運(yùn)動(dòng)員實(shí)施血檢、尿檢結(jié)合的方法對其進(jìn)行檢測［34］。

世界反興奮劑組織采用的方法是由 Lasne等［35，36］于2002年提出的等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)結(jié)合免疫雙印跡化學(xué)發(fā)光法。該方法基于rhEPO與內(nèi)源性EPO等電點(diǎn)的不同從而判斷被檢測者是否濫用該類藥物。樣品經(jīng)過有效富集后進(jìn)行等電聚焦，之后將凝膠上的條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上進(jìn)行二次印跡，二次印跡可以有效地阻止第二抗體的非特異性結(jié)合，從而避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，最后在發(fā)光氨和過氧化氫的作用下進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。該方法的誤檢率僅為0.006% ～0.03%。最近，針對此方法研制了特定的圖像分析軟件GASepo，可進(jìn)行閾值計(jì)算、條帶分割和算法分類，從而達(dá)到對EPO定量的目的［37］。

3 電化學(xué)方法

電化學(xué)方法不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和衍生過程，在興奮劑檢測領(lǐng)域已針對一些特定的具有電活性的物質(zhì)發(fā)展出相應(yīng)的電化學(xué)分析方法。Goyal等［38，39］利用循環(huán)伏安法、示差脈沖伏安法和方波伏安法構(gòu)建了對諾龍的電化學(xué)分析方法。他們采用示差脈沖伏安法在pH為7.2的條件下，使用金納米顆粒修飾的銦錫氧化物電極，在諾龍癸酸鹽濃度為50 nmol/L～1.5 μmol/L的范圍內(nèi)研究得到了良好的線性曲線，檢出限為1.36×10–7mol/L［38］。他們還研究了不同電極對諾龍電化學(xué)行為的影響，結(jié)果表明與裸玻碳電極相比，富勒烯修飾電極對諾龍表現(xiàn)出更好的催化活性。利用方波伏安法得到的諾龍的線性濃度范圍為0.1 nmol/L～50 μmol/L，檢出限為0.42 nmol/L［39］。電化學(xué)法對人血清和尿液中諾龍的測定結(jié)果與GCMS測定結(jié)果有很好的一致性。

4 基因興奮劑的檢測

基因治療技術(shù)的出現(xiàn)，導(dǎo)致部分運(yùn)動(dòng)員通過使用基因興奮劑來達(dá)到提高成績目的，因此從2003年開始，國際奧委會(huì)將基因興奮劑列入違禁藥物的黑名單。2008年禁用清單中規(guī)定“禁止非治療性使用細(xì)胞、基因、遺傳構(gòu)件，或調(diào)控基因表達(dá)的方法來提高運(yùn)動(dòng)能力”。德國科隆體育學(xué)院在2009年3月21日表示，已開發(fā)出新的利用質(zhì)譜檢測基因興奮劑的方法，通過該方法可以檢測出可被用于提高耐力的禁藥GW1516，該方法將從 2012年倫敦奧運(yùn)會(huì)開始使用［40］。

用于基因轉(zhuǎn)移的DNA來自人類本身，因此與其他興奮劑相比，基因興奮劑的隱蔽性更強(qiáng)，檢測方法也更難?，F(xiàn)在的檢測手段雖然能檢測一些已知基因興奮劑，但是對于絕大多數(shù)基因興奮劑還沒有相應(yīng)的檢測辦法，目前主要是從基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行研究。因?yàn)閏DNA中沒有內(nèi)含子，所以有可能把編碼轉(zhuǎn)基因蛋白的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA從自身的DNA序列中區(qū)分出來，可以通過PCR、Southern印跡、分子探針以及基因測序等技術(shù)檢測外源基因，從而實(shí)現(xiàn)對基因興奮劑的檢測［41］?；蚺d奮劑的使用也會(huì)改變目的基因及上下游基因的表達(dá)水平，可利用cDNA微陣列技術(shù)和基因表達(dá)系列分析技術(shù)等技術(shù)對相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，進(jìn)而判斷是否使用了基因興奮劑［42］。蛋白質(zhì)組學(xué)可以定量分析個(gè)體蛋白，也可以定性分析、鑒別個(gè)體蛋白的亞型，因此也可以通過檢測目的蛋白質(zhì)和上下游相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變，或利用免疫學(xué)技術(shù)檢測外源蛋白質(zhì)所引起的免疫效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)基因興奮劑的檢測［43］?？傊壳盎蚺d奮劑的檢測還面臨著轉(zhuǎn)入部位的確定、取材和載體進(jìn)入體內(nèi)的代謝時(shí)間不確定等很多問題，有待進(jìn)一步深入研究。

5 結(jié)論

隨著檢測儀器的發(fā)展和跨學(xué)科研究的深入，越來越多的技術(shù)被應(yīng)用于興奮劑檢測，檢測技術(shù)也越來越準(zhǔn)確、便捷、快速。在眾多檢測方法中，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)仍是興奮劑檢測的主要方法，氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法以及不斷衍生的各類質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可被用于檢測大部分興奮劑。免疫分析法主要被用于檢測類固醇類興奮劑和激素類興奮劑。電化學(xué)法只能針對具有特定電活性的物質(zhì)進(jìn)行檢測。基因興奮劑的檢測仍處在初級階段，應(yīng)加強(qiáng)跨學(xué)科合作，探索出準(zhǔn)確快捷的基因興奮劑檢測方法。

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Advance in Doping Detection Methods

LI WEI-dong
(Department of Physical Education and ministry of public health，Tianjin 300134，China)

The commonly used doping control methods are gas chromatography，high performance liquid chromatography，gas chromatography-mass spectrometry，liquid chromatography-mass spectrometry，chemiluminescence immunoassay and electrochemical method.Chromatography-mass spectrometry is still the main method of doping control.Gas chromatographymass spectrometry，liquid chromatography-mass spectrometry and the various types of mass spectrometry which are derivatived continuously can be used to detect most of the stimulants.Immunosorbent assay is primarily used to detect the steroid stimulants and hormone doping.Electrochemical method only can detect the material with specific electrical activity.Detection of gene doping is still in early stages.

doping detection;chromatography/mass spectrometry;immunosorbent assay;gene doping

G804.7

A

1007-323X(2012)03-0038-06

2011-10-09

李衛(wèi)東(1973-)，男，天津市人，副教授

研究方向:運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)