紀少軍，萬立，李鳳玉，賈國洪，閆永宏，石軍

(解放軍第二五一醫(yī)院急診科，河北張家口 075000)

創(chuàng)面愈合是一個復雜的生物學過程，包括炎癥反 應、細胞增殖、創(chuàng)面收縮和膠原代謝等基本環(huán)節(jié)。成纖維細胞作為創(chuàng)面修復的主要細胞之一［1］，其增殖和膠原合成的變化直接影響創(chuàng)面修復的結局。我們既往研究證實，細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以刺激正常人皮膚成纖維細胞增殖［2］。為了探討LPS在創(chuàng)面修復中的作用，我們研究LPS對正常人皮膚成纖維細胞膠原合成的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

標本來源于我科收治的整形患者20例，其中男11例，女9例，年齡2～56歲，平均(20±15)歲。

1.2 主要試劑及儀器

Dulbecco改良的培養(yǎng)基;LPS E．coli 055:B5;胎牛血清;L-脯氨酸;3H-脯氨酸;酶聯(lián)免疫標記儀。

1.3 成纖維細胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)采用組織塊法［3］。

1.4 LPS作用濃度

用4%基礎培養(yǎng)基稀釋LPS，參照既往研究報告確定 LPS 的實驗濃度［2，4］，作用濃度為 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 和 1.0 μg·ml-1。

1.5 成纖維細胞膠原合成的檢測

取對數生長期的成纖維細胞，以含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基制成1×104個·ml-1的細胞懸液，接種于96孔平底培養(yǎng)板中，每孔200 μl，在相同培養(yǎng)條件下，細胞貼壁后，各組正常成纖維細胞更換預先配置的LPS工作液，每個LPS濃度設4個平行孔。以加LPS工作液時間為準，第2天將24 h標記期的3H-脯氨酸摻入(摻入量0.5 μCi·孔-1)穩(wěn)態(tài)、融合的單層培養(yǎng)成纖維細胞中［5］，第3天采用胃蛋白酶消化法檢測培養(yǎng)液中膠原量，實驗結果以dpm·(1 000細胞)-1表示。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

LPS對正常人皮膚成纖維細胞膠原合成的影響:LPS刺激濃度在0.005～0.5 μg·ml-1時，促進正常皮膚成纖維細胞的膠原合成。LPS濃度在0.005～0.1 μg·ml-1時，LPS刺激濃度和成纖維細胞膠原合成之間存在量效依賴關系;當LPS濃度為0.5 μg·ml-1時，促成纖維細胞膠原合成作用開始降低，當LPS濃度達到1 μg·ml-1時，成纖維細胞膠原合成受到抑制。其中，LPS 濃度為 0.05 μg·ml-1和 0.1 μg·ml-1時，膠原合成量分別為(391.75±14.198)和(435.00±17.473)dpm·(1000細胞)-1，顯著高于正常皮膚成纖維細胞［(281.50±17.540)dpm·(1 000細胞)-1］(P ＜0.01)。當 LPS 濃度達到1.0 μg·ml-1時，已明顯抑制成纖維細胞膠原合成［(215.00±19.148)dpm·(1 000細胞)-1］(P ＜0.01)。

3 討 論

成纖維細胞作為創(chuàng)面修復的主要細胞，它能分泌膠原蛋白等細胞外基質，可以通過分泌一氧化氮合酶和角質化細胞生長因子等細胞因子對創(chuàng)傷修復過程起調節(jié)作用。創(chuàng)傷環(huán)境及創(chuàng)面外用藥物都在一定程度上含有LPS。我們既往研究證實，細菌LPS可以刺激正常人皮膚成纖維細胞增殖［2，6］。而通過刺激成纖維細胞增殖和膠原合成是許多藥物促進創(chuàng)面修復的主要機制之一。因此，研究LPS對成纖維細胞增殖和膠原合成的影響，對闡明LPS對創(chuàng)傷愈合的影響具有重要意義。

3H-脯氨酸摻入實驗結果顯示，LPS對成纖維細胞膠原合成也具有雙重作用，低濃度時促進成纖維細胞膠原合成，高濃度時抑制成纖維細胞膠原合成;其原因可能是:(1)通過刺激或抑制成纖維細胞的增殖，使成纖維細胞數量改變，影響膠原合成;(2)LPS改變了成纖維細胞的生物學特性，使單個成纖維細胞的膠原合成量增加。李從青等［7］研究也證實了LPS通過與單核細胞表面CD14分子或可溶性CD14分子作用，將細胞信號傳導到胞核而刺激多種細胞合成和釋放細胞因子。徐荔等［8］的研究也證實了LPS對細胞因子的合成和釋放具有促進作用。LPS對成纖維細胞膠原合成的作用可能與其對細胞因子的影響有關。

綜上所述，LPS改變了正常人皮膚成纖維細胞的某些生物學特性，通過促進膠原蛋白合成而促進創(chuàng)面愈合，并且不同濃度LPS在創(chuàng)面愈合中的作用不同。

［1］KOHYAMA T，LIU X，WEN F Q，et al.Cytokines modulate cilomilast response in lung fibroblasts［J］.Clin Immunol，2004，111(3):297-302.

［2］楊紅明，付小兵，柴家科，等.脂多糖對皮膚纖維母細胞和表皮細胞的影響［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2000，25(6):428-429.

［3］BABU M，DIEGELMANN R，OLIVER N.Fibronectin is overproduced by keloid fibroblasts during abnormal wound healing［J］.Mol Cell Biol，1989，9(4):1642-1650.

［4］YANG H M，KANKO M，HE C，et al.Effect of a lipopolysaccharide from E．coli on the proliferation of fibroblasts and kera-tinocytes in vitro［J］.Phytother Res，2002，16(1):43-47.

［5］董波，陳肖華，張浩，等.一種改進的用于測定細胞周期的細胞制備方法［J］.軍事醫(yī)學科學院院刊，2002，26(2):124-129.

［6］倪杰，戴厚永，鄭敏，等.抗體芯片在糖尿病腎病大鼠尿液細胞因子同步檢測中的應用［J］.東南大學學報:醫(yī)學版，2012，31(3):249-253.

［7］李從青，姚潔，劉長明，等.內毒素對妊娠期糖尿病患者外周血單核細胞TLR-4 mRNA及NFκ-B mRNA表達的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2011，11(3):50-53.

［8］徐荔，何小鵑，柴旺，等.黃芪多糖對內毒素誘導巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β及NO的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011，17(5):62-63.