董健

（上海賽金生物醫(yī)藥有限公司，上海201203）

單抗類藥物的免疫原性問題及其控制

董健

（上海賽金生物醫(yī)藥有限公司，上海201203）

單抗類藥物（單克隆抗體藥物和受體-Fc融合蛋白藥物）近年來在癌癥和自身免疫性疾病等領(lǐng)域取得了顯著的療效。根據(jù)誘發(fā)的抗藥物抗體的類型不同，單抗類藥物的免疫原性可能導(dǎo)致不同的臨床后果，直至影響單抗類藥物的有效性和安全性。單抗類藥物免疫原性的發(fā)生機制尚沒有明確的定論，可能與多種因素有關(guān)，其中蛋白質(zhì)多聚體對免疫原性有顯著影響。根據(jù)“質(zhì)量源于設(shè)計”的原則，從單抗類藥物的分子設(shè)計和工藝設(shè)計出發(fā)，采取人源化改造、開發(fā)人類抗體、檢測和控制產(chǎn)品中多聚體含量等，有助于降低單抗類藥物的免疫原性，實現(xiàn)單抗類藥物的有效性、安全性和可生產(chǎn)性之間的平衡。

單克隆抗體；融合蛋白；免疫原性；多聚體

1 單抗類藥物的應(yīng)用與免疫原性

單克隆抗體藥物和諸如依那西普的受體-Fc融合蛋白藥物（以下統(tǒng)稱為“單抗類藥物”），具備與特定生物學(xué)靶點精準結(jié)合的能力，為患者提供了更好的治療選擇，近年來在癌癥和自身免疫性疾病等領(lǐng)域均取得了顯著的療效。全球已有數(shù)以百萬計的患者使用單抗類藥物，中國患者使用單抗類藥物的數(shù)量近年也出現(xiàn)明顯增長。

單抗類藥物的原研藥一般都來自歐美藥廠，價格高昂。不過，一些重量級單抗類藥物專利即將過期，為各國開發(fā)生物類似藥（biosimilar）和生物仿制藥（me-too biologics）提供了巨大的機遇。中國市場潛力巨大，發(fā)展單抗類生物仿制藥，可以顯著地降低單抗類藥物價格，造福我國患者。我國“十二五”規(guī)劃將大力扶持生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，單抗類仿制藥是各地發(fā)展生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重點之一，會有越來越多的單抗類藥物供我國醫(yī)生、藥師和患者研究和使用。

與其他藥物一樣，單抗類藥物也有毒副作用，包括首次給藥反應(yīng)和免疫原性（immunogenicity）等。首次給藥反應(yīng)可能是由抗體Fc區(qū)介導(dǎo)，激活了細胞因子的釋放。首次給藥反應(yīng)往往是暫時性的，會隨著后續(xù)給藥而消失[1]。而單抗類藥物的免疫原性則是由患者機體產(chǎn)生的抗藥物抗體引起，從而對單抗類藥物的有效性和安全性產(chǎn)生不同程度的影響。

藥物的免疫原性，通常是指其誘發(fā)抗藥物抗體反應(yīng)的能力。這種反應(yīng)的分子基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)降解后產(chǎn)生肽段（表位），如果這些表位被免疫系統(tǒng)識別為異源的，會誘導(dǎo)產(chǎn)生抗藥物抗體。

所有的外源性蛋白，包括用于治療的蛋白質(zhì)藥物，都有引起抗體形成的可能性[2]。單抗類藥物與其他蛋白質(zhì)藥物一樣，有在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的潛力，誘發(fā)產(chǎn)生抗抗體[3]，影響其有效性和安全性[4]。單抗類藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗抗體包括阻斷單抗類藥物與靶點結(jié)合的阻斷抗體和與單抗類藥物結(jié)合導(dǎo)致其功能喪失或被清除的中和抗體等。

免疫原性有可能導(dǎo)致不同的臨床后果。如果免疫原性誘發(fā)的抗抗體是中和抗體，則比非中和抗體更有可能導(dǎo)致藥效降低。另外，免疫原性有可能引起溫和或嚴重的不良反應(yīng)。

早在20世紀90年代中期，即單抗類藥物即將進入其臨床應(yīng)用的黃金時代之際，研究人員就已經(jīng)非常關(guān)注免疫原性對單抗類藥物的應(yīng)用、藥效和未來發(fā)展的影響[5]。例如，Norman DJ等于1993年指出，接受OKT3治療的患者中，50%的患者產(chǎn)生了干擾OKT3與T細胞結(jié)合的阻斷抗體[6]，對治療效果有負面影響。其他的單抗類藥物在取得良好治療效果的同時，不同程度地遇到了過敏反應(yīng)和抗-抗體反應(yīng)（AAR），即人對外源免疫球蛋白的免疫反應(yīng)，包括人抗鼠抗體反應(yīng)（HAMA）、人抗嵌合抗體反應(yīng) （HACA）、人抗人源化抗體反應(yīng)（HAHA）。這些反應(yīng)有時會產(chǎn)生嚴重的臨床后果。

無論是藥品監(jiān)管部門，還是從事單抗類藥物原研藥、生物類似藥或生物仿制藥開發(fā)和生產(chǎn)的制藥企業(yè)，以及在臨床上評價和使用單抗類藥物的醫(yī)生、執(zhí)業(yè)藥師和患者，都需要關(guān)注和了解單抗類藥物的免疫原性問題。而且，不僅僅需要重視新上市單抗類藥物的免疫原性評價，也需要重視已上市產(chǎn)品生產(chǎn)工藝變更或產(chǎn)品特性改進后的免疫原性評價。

歐美國家的藥品監(jiān)管部門已經(jīng)發(fā)布過一些有關(guān)抗抗體臨床評價的白皮書和指南，對免疫原性篩選框架給出了比較明確的界定。概言之，應(yīng)在單抗類藥物開發(fā)階段進行風(fēng)險分析，評估其免疫原性的發(fā)生概率和可能引起的不良反應(yīng)的嚴重性，系統(tǒng)性地評估和降低其風(fēng)險，考慮免疫原性對于藥物的利益/風(fēng)險平衡的整體性影響，從而提高藥物開發(fā)的成功率[7]。

我國的“人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”針對單抗藥物的免疫原性問題也作出了具體規(guī)定，例如要求“盡可能選用一些不引起免疫球蛋白聚合、變性等的純化方法及條件”，“多聚體應(yīng)≤10%”，“單克隆抗體的臨床前試驗，包括免疫原性、穩(wěn)定性、組織交叉反應(yīng)性和效應(yīng)功能”等。

2 引起免疫原性的原因

單抗類藥物免疫原性的發(fā)生機制尚沒有明確的定論，可能與多種因素有關(guān)，包括患者的遺傳背景、疾病類型、蛋白質(zhì)類型（鼠源或人源）、翻譯后修飾、氧化或形成多聚體改變蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、給藥途徑、給藥頻率、療程長短、藥物的生產(chǎn)和貯存等。

單克隆抗體技術(shù)發(fā)展的早期階段所采用的雜交瘤技術(shù)只能生產(chǎn)鼠源抗體，因此，20世紀80年代進入臨床試驗的80%的單克隆抗體都是鼠源抗體[8]。鼠源抗體可能誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗小鼠抗體或人抗大鼠抗體[9-10]，有可能阻斷或清除鼠源抗體的作用，對其療效和影像學(xué)形成負面影響[5]?？贵w結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)方面的進展使得可以將一些鼠源抗體改造為嵌合或人源化抗體。噬菌體展示文庫和轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的出現(xiàn)，使得不需要鼠源抗體作為起點，就可以產(chǎn)生人類抗體（human antibody）。一般認為，依產(chǎn)生抗抗體的可能性順序而言，鼠源單抗最強，其次為嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體，因此，一般認為人類抗體或人源化抗體比鼠源抗體安全，因此，2000年左右進入臨床試驗的單克隆抗體中，只有7%是鼠源抗體[11]。不過，即使是人源化抗體或人類抗體，亦有可能誘發(fā)抗藥物抗體的產(chǎn)生，人源化抗體，如抗 CD3（teplizumab）[12-13]、抗CD52（阿倫單抗）以及阿達木單抗都曾誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗人抗體[14]。

蛋白質(zhì)的天然修飾（例如翻譯后的糖基化）或人為修飾（例如PEG化）等也可能改變單抗類藥物的免疫原性。給藥途徑對免疫原性亦有影響。藥物在肌內(nèi)注射時的免疫原性可能會低于靜注或皮下注射時的免疫原性。如果注射的組織內(nèi)抗原呈遞細胞如樹突細胞的數(shù)量比較少，則免疫原性的風(fēng)險會比較低。疾病的類型、患者的狀態(tài)以及先前給藥或協(xié)同給藥，亦會影響免疫原性。例如，阿達木單抗在與甲氨蝶呤協(xié)同給藥時，只在1%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者中表現(xiàn)出免疫原性，與其單獨給藥時12%的不良免疫應(yīng)答形成鮮明的對比[15-16]。

為得到高純度、穩(wěn)定、安全和有效的單抗類藥物，需要經(jīng)過復(fù)雜的生產(chǎn)工藝和比較長的生產(chǎn)周期。生產(chǎn)工藝的各個步驟，包括細胞培養(yǎng)、純化、制劑及成品的貯存和操作，以及西林瓶或預(yù)充注射器和膠塞等內(nèi)包材在內(nèi)的因素，都有可能影響免疫原性[17]。如果產(chǎn)品和工藝開發(fā)不完善，生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，加上蛋白質(zhì)在體外的不穩(wěn)定性，可能會引起生物學(xué)活性變化，增強其免疫原性，影響成品的有效性和安全性。因此，在關(guān)注單抗類藥物的免疫原性時，需要仔細監(jiān)控生產(chǎn)工藝的每一個步驟，包括制劑和包裝這些看起來重要性低于細胞培養(yǎng)和純化的生產(chǎn)步驟。另外，在引入任何產(chǎn)品和工藝變更時，都必須仔細考慮是否會影響單抗類藥物的免疫原性[18]。

例如，過去曾發(fā)現(xiàn)內(nèi)包材與藥物相互作用，影響了蛋白質(zhì)藥物促紅細胞生成素（EPO）的免疫原性[19-20]。在EPO制劑配方中加入吐溫80（polysorbate 80）后，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)再生障礙性貧血的患者比例上升。經(jīng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)吐溫80與預(yù)充注射器的未覆膜膠塞發(fā)生作用，產(chǎn)生有機析出物。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)這些析出物具有佐劑的作用，增強了EPO成品的免疫原性。后來，改用FluroTec覆膜的膠塞，避免了有機析出物的產(chǎn)生，結(jié)合其他降低風(fēng)險的措施，降低了抗體介導(dǎo)的純紅細胞再生障礙的發(fā)生比例。

以上實例表明，在變更制劑配方時，必須避免由此造成對安全性和有效性的不良影響。另外，單抗類藥物的生產(chǎn)廠家，在內(nèi)包材選型時，應(yīng)考慮采用優(yōu)質(zhì)內(nèi)包材。內(nèi)包材如西林瓶或預(yù)充注射器，及其用于密封的膠塞等，直接與藥品接觸，內(nèi)包材的玻璃表面、空氣-液體界面及潤滑劑等可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，而膠塞則可能包含對藥品有不良影響的提取物和析出物，可能影響藥效和免疫原性。因此，各國藥品監(jiān)管當(dāng)局將內(nèi)包材的變更視為高風(fēng)險變更。國內(nèi)優(yōu)質(zhì)生物仿制藥如強克○R等，就采用了質(zhì)量一流的西林瓶與膠塞，為藥品質(zhì)量提供了必要保證。

在單抗類藥物的開發(fā)與生產(chǎn)中，還需要關(guān)注蛋白多聚體等因子對免疫原性的影響[21]，因為過往的研究表明，多聚體是導(dǎo)致免疫原性的重要因素之一。蛋白質(zhì)多聚體是由天然或變性單體組成的多體構(gòu)成的高分子量蛋白質(zhì)。在不同的環(huán)境中，多聚體的形成有可能是可逆或不可逆的，可以是可溶性或不溶性的。

在研究不依賴T輔助細胞的抗體應(yīng)答時，Dintzis RZ等[22]認為B細胞的刺激信號必須以足量的方式呈現(xiàn)，使得細胞表面表達的抗原受體，以超過一定數(shù)量的緊密相連的簇的形式構(gòu)成一個 “免疫子”（immunon）；構(gòu)成這種刺激信號的多聚體分子量不能低于100 kDa，且半抗原價數(shù)不得低于10。后續(xù)的研究工作表明，B細胞激活和抗體產(chǎn)生不僅僅依賴于分子量和半抗原價數(shù)，亦有賴于半抗原親和性、多聚體牢固性和結(jié)合動力學(xué)[23]。

Bachmann MF等[24]指出，疏松的多聚體可以誘導(dǎo)依賴T輔助細胞的抗體產(chǎn)生，而高度結(jié)構(gòu)化的病毒殼體可以在沒有T細胞輔助的情況下誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，清楚地證明了高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)多聚體在誘發(fā)快速和有效的免疫應(yīng)答方面的能力。Rosenberg AS[25]認為，處于高度陣列結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)抗原，例如那些在非還原多聚體中的蛋白質(zhì)抗原，可以在沒有T細胞輔助的情況下，誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。多價蛋白質(zhì)可以交聯(lián)B細胞受體，通過Bt激酶激活B細胞進行增殖，將蛋白質(zhì)導(dǎo)向Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的裝載腔室，有效地誘發(fā)T細胞輔助的抗體應(yīng)答。

以上研究工作表明，高分子量的聚集抗原陣列可以高效地誘導(dǎo)不依賴T細胞輔助的抗體應(yīng)答，而結(jié)構(gòu)松散的聚集抗原可能需要T細胞輔助才能產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？傊话阏J為形成多聚體的蛋白質(zhì)比天然蛋白質(zhì)更容易被免疫系統(tǒng)識別。

半個多世紀以來，隨著靜注免疫球蛋白和人生長激素（hGH）的臨床應(yīng)用，已經(jīng)對蛋白質(zhì)多聚體與抗體介導(dǎo)的不良反應(yīng)之間的關(guān)系有了清晰的理解，認識到蛋白質(zhì)多聚體可以增強針對蛋白質(zhì)單體的免疫應(yīng)答能力。

例如，20世紀50至60年代在嚙齒類實驗動物中注射人免疫球蛋白的研究表明，通過去除人免疫球蛋白制備物中的高分子量成分，可以消除對人免疫球蛋白制備物的免疫應(yīng)答[26]。研究表明，這種抗體應(yīng)答，對多聚體特有的決定簇（即僅由高級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)）或在變性蛋白質(zhì)多聚體表面暴露出來的隱蔽決定簇有特異性[27]。又例如，hGH的臨床應(yīng)用表明，那些使用較高含量多聚體的hGH患者的抗hGH抗體持續(xù)存在，而使用較低含量多聚體的患者僅有短暫的抗體應(yīng)答[28]。重組白介素-2（IL-2）是以多聚體的形式進行配制的，平均每個多聚體內(nèi)含有27個單體IL-2，大多數(shù)的多聚體分子量超過100 kDa且含有超過20個以上的配體，因此該產(chǎn)品具有高度的免疫原性，在80%～100%的患者中誘發(fā)了結(jié)合抗體應(yīng)答[29]。

因此，為降低蛋白質(zhì)藥物（包括單抗類藥物）的免疫原性，有必要確保蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的穩(wěn)定性，避免高分子量多聚體的形成。

3 評價免疫原性的方法

鑒于免疫原性對單抗類藥物有效性和安全性的不良影響，有必要采取措施，對處于研發(fā)階段和臨床應(yīng)用階段的單抗類藥物的免疫原性進行評估和篩選，為規(guī)避或控制單抗類藥物免疫原性所帶來的風(fēng)險提供依據(jù)。

通過檢測動物或患者體內(nèi)抗抗體等生物學(xué)分析方法，可以評估生物制品的免疫原性[30]。一般認為，傳統(tǒng)的動物模型如獼猴、兔子、大鼠或小鼠，預(yù)測免疫原性的能力有限，臨床試驗是最好的評估免疫原性的方法。未來需要開發(fā)專門設(shè)計的動物模型，包括靈長類動物和轉(zhuǎn)基因小鼠，預(yù)測新單抗類藥物的免疫原性。

研究人員也在嘗試采用計算機（in silico）篩選法[31]，以及檢測T細胞應(yīng)答的體外檢測方法評估單抗類藥物的免疫原性。計算機篩選法，就是采用免疫信息學(xué)的運算法則，鑒別和計算形成免疫原性的主要因素T細胞表位的數(shù)量。例如，將蛋白質(zhì)序列分成重疊的9個氨基酸的肽段框架，評價每個肽段與覆蓋絕大多數(shù)人類遺傳背景的8個常見Ⅱ型人類白細胞抗原（HLA）的結(jié)合能力，得到蛋白質(zhì)藥物的“免疫原性分數(shù)”，并據(jù)此將蛋白質(zhì)藥物的免疫原性風(fēng)險進行分級，有利于在臨床前階段預(yù)判新藥的臨床免疫原性風(fēng)險。

鑒于蛋白質(zhì)多聚體是增強免疫原性的重要因素之一，需要在生產(chǎn)過程、中間產(chǎn)品和成品中監(jiān)測與控制多聚體含量。一般通過分子尺寸排阻高效液相色譜法（SEC-HPLC）檢測產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)多聚體，該方法具有靈敏度高的特點，但是也有缺陷，例如某些高分子量的多聚體可能不能通過，因此，應(yīng)采取與SEC-HPLC正交的方法予以補充，例如光學(xué)、熒光和電子顯微鏡術(shù)，濁度法，質(zhì)譜法，電泳法，UV-VIS光譜法，紅外光譜法，熒光光譜法，圓二色譜法（CD），核磁共振等。

4 降低免疫原性的方法

可根據(jù)“質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）”的原則，從單抗類藥物的分子設(shè)計和工藝設(shè)計出發(fā)，降低單抗類藥物的免疫原性，實現(xiàn)單抗類藥物的有效性、安全性和可生產(chǎn)性之間的平衡。下面介紹了幾種通過分子設(shè)計和工藝設(shè)計降低單抗類藥物免疫原性的策略。

人源化技術(shù)，即將鼠源單抗的恒定區(qū)及可變區(qū)的框架區(qū)用人類序列替換，可以實現(xiàn)鼠源單抗的人源化改造，從而顯著地降低免疫原性[11，32]。而轉(zhuǎn)基因小鼠和噬菌體展示等技術(shù)，使得可以選擇與人類種系序列高度同源的抗體序列，以降低免疫原性的風(fēng)險。即便如此，局部人源化的單抗，甚至完全人源化單抗仍然有免疫原性風(fēng)險[32]。

降低免疫原性的另一種思路是“去免疫化”，即通過去除T細胞表位，避免與HLA結(jié)合。這種思路與腫瘤細胞或其他病原體逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的方式相類似。

如前所述，蛋白質(zhì)多聚體對免疫原性有重要影響。多聚體在單抗類藥物的生產(chǎn)、貯存、運輸和向患者交付的過程中都有可能形成，因為這些過程中的各種物理和化學(xué)因子都有可能誘導(dǎo)多聚體形成，包括溫度波動、光照、搖晃、表面效應(yīng)、pH調(diào)整等[33-34]。形成的多聚體直徑從幾納米到幾毫米不等。如果形成多聚體的根源沒有消除，則除菌過濾不會起到去除多聚體的作用，因為多聚體會在除菌過濾后再次形成[35]。因此，可在產(chǎn)品和工藝開發(fā)階段，按照QbD的原則，深入研究和開發(fā)單抗類藥物的細胞培養(yǎng)、純化、制劑工藝條件，包裝和貯存條件，避免或盡量減少蛋白質(zhì)多聚體的形成。

例如，UCB公司改進了新單抗藥物的純化工藝，減少了多聚體的產(chǎn)生，結(jié)合新的制劑配方，使得在用藥96周后，產(chǎn)生中和抗體的患者比例降低了20%[36]。又如，我國新近批準的單抗類生物仿制藥如強克○R

，在細胞培養(yǎng)和純化工藝開發(fā)上借鑒了國際先進理念、先進技術(shù)，在純化工藝中不但設(shè)計了去除多聚體的工藝步驟，而且使用了性能穩(wěn)定、技術(shù)先進的層析填料，有效地減少和控制了多聚體含量。其純度和大分子量物質(zhì)（多聚體）的標準比之前批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量標準更為嚴格，體現(xiàn)了我國單抗類藥物生產(chǎn)技術(shù)和質(zhì)量管理水平的進步。

需要注意的是，無論怎樣優(yōu)化生產(chǎn)工藝、配方和貯存與運輸條件，都不可能徹底地去除或避免多聚體的產(chǎn)生。另外，還需要建立穩(wěn)定靈敏、重復(fù)性好的定量檢測多聚體的方法，例如SEC-HPLC和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳/SDS-毛細管電泳（CE-SDS），用于監(jiān)控生產(chǎn)過程中間體、原液和成品的純度和多聚體水平，從而降低由其引起的免疫原性。

5 結(jié)論

單抗類藥物近年來在癌癥和自身免疫性疾病等領(lǐng)域取得了顯著的療效和廣泛的應(yīng)用。與其他藥物一樣，單抗類藥物也有毒副作用，包括首次給藥反應(yīng)和免疫原性等。根據(jù)誘發(fā)的抗藥物抗體的類型不同，免疫原性有可能導(dǎo)致不同的臨床后果，直至影響單抗類藥物的有效性和安全性，值得藥品監(jiān)管部門、制藥企業(yè)、醫(yī)生和執(zhí)業(yè)藥師、患者關(guān)注。免疫原性的發(fā)生機制尚沒有明確的定論，與多種因素都可能有關(guān)系，其中蛋白質(zhì)多聚體對免疫原性有顯著影響。根據(jù)QbD的原則，從單抗類藥物的分子設(shè)計和工藝設(shè)計出發(fā)，采取人源化改造、開發(fā)人抗體、檢測和控制產(chǎn)品中多聚體含量等，有助于降低單抗類藥物的免疫原性，實現(xiàn)單抗類藥物的有效性、安全性和可生產(chǎn)性之間的平衡。

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The Immunogenicity and Control of Therapeutic Monoclonal Antibodies

Dong Jian(Shanghai Celgen Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Therapeutic monoclonal antibodies and receptor-Fc fusion proteins have exhibited excellent efficacy in the treatment of cancer and autoimmune diseases.The immunogenicity of these biotherapeuticsmay impact their safety and efficacy profile，depending on the nature of the anti-drug antibodies elicited.The exact mechanism of such immunogenicity is unclear， however， it is associated with many different inherent and external conditions.Protein aggregates have been known contributing to immunogenicity.Rational design of molecular sequence and production process under the guidance of Quality by Design，including the development of humanized antibody and fully human antibody， and quantification and control of protein aggregates of the drug product， w ill help to reduce or eliminate immunogenicity and keep the balance between efficacy，safety and manufacturability of such biotherapeutics.

Monoclonal Antibody；Fusion Protein；Immunogenicity；Aggregates

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.09.004

董健，男，生物學(xué)碩士，工商管理碩士，制藥高級工程師。研究方向：生物制品生產(chǎn)及質(zhì)量管理。E-mail：dongjian2005@gmail.com

2012-05-02）