強北平，Bradley Strauss

冠狀動脈慢性全梗阻(CTO) 是指梗阻3 個月以上，冠狀動脈造影TIMI 分級為0 或1 級的病變。CTO 病變極為常見，約占冠心病患者的30%左右［1］。臨床研究表明，CTO 的成功再通治療，能顯著改善患者心絞痛癥狀，左室功能，減低冠心病死亡率［2］。針對CTO 的介入再通治療，約占全部PCI (Percutaneous Coronary Intervention) 的8% ～15%，CTO 介入治療成功與否的關(guān)鍵是能否將導引鋼絲通過病變，達到CTO 的遠端。在過去的臨床及實驗研究中，幾乎所有的努力都集中在使用更為堅硬的導引鋼絲。但由于CTO 纖維瘢塊中存有大量的膠原纖維和鈣化，使纖維瘢塊極其堅硬，導引鋼絲往往極難通過，其介入治療成功率僅在60%左右［3］。這促使我們試圖尋找一種將CTO 中纖維瘢塊軟化，以利于導引鋼絲通過CTO 病變的方法。

膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix Metalloproteinase，MMP) 的一種，其主要作用是降解基質(zhì)中的膠原纖維。CTO瘢塊的主要組成成分是膠原纖維，是導引鋼絲通過CTO 病變的主要障礙。本實驗室在過去的10 年中利用實驗性CTO 動物模型發(fā)現(xiàn)膠原酶能降解CTO 瘢塊中的膠原纖維軟化纖維瘢塊顯著性的改善導引鋼絲通過CTO 病變的成功率； 并對純化的臨床級別膠原酶進行了劑量和安全性實驗研究。為了進一步了解膠原酶對心肌的影響，向豬的正常冠狀動脈內(nèi)注射不同劑量的膠原酶，發(fā)現(xiàn)在急性期(24h 內(nèi)) 心肌組織有劑量依賴性的灶性出血； 低中劑量很安全，無心肌出血。膠原酶臨床一期劑量和安全性研究已經(jīng)完成，膠原酶治療病例導引鋼絲通過病變的成功率為75%，患者臨床癥狀明顯緩解。進一步的臨床實踐和國際性合作正逐步展開。

利用實驗性CTO 動物模型進行了大量的實驗研究，試圖利用膠原酶軟化纖維瘢塊，促進CTO 的介入再通治療。本文在此對這些實驗研究予以綜述。

1 實驗性CTO 模型的病理特點

所有動物實驗都經(jīng)多倫多大學附屬St Micheal's 醫(yī)院和Sunnybrook 醫(yī)院動物保護委員會同意。家兔股動脈CTO 模型制作如曾經(jīng)報道過的方法［4］，將100U 牛血清凝血酶，注入兩端阻斷的約2cm 長的股動脈段內(nèi)，靜置1h 以形成穩(wěn)定的血栓。然后移去結(jié)扎線，飼養(yǎng)動物12 ～15 周后，病變演變?yōu)槁匀Ｗ栌糜谀z原酶的應(yīng)用研究。臨床病理顯示人冠狀動脈CTO 內(nèi)有大量的膠原纖維，尤其在CTO 近端，形成所謂“近端纖維帽”，此處是介入治療時導引鋼絲最難通過處，是介入再通治療的主要障礙之一［5］。組織病理學研究表明，家兔股動脈CTO 模型經(jīng)歷了一個負性重塑過程。第2 周時，梗阻的血栓內(nèi)形成了大量富含蛋白多糖的細胞外基質(zhì)，基質(zhì)成片狀沉積，隨后蛋白多糖含量隨時間逐漸減低，膠原纖維含量則逐漸增高。膠原纖維在第2 周時尚未出現(xiàn)，到第6 周時其含量達10%左右； 至18 周以后其含量已達15%。縱觀研究顯示，CTO 近端有致密的斑塊狀膠原沉積［6］，這些特點與人冠狀動脈CTO 極為相似(見圖1) 。

2 膠原酶

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase) ，它能在生理pH 和溫度條件下特異性地切割膠原蛋白中甘氨酸殘基的氨基端鈦鍵，從而水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織人體內(nèi)部存在的膠原酶稱為內(nèi)源性膠原酶，對于體內(nèi)膠原蛋白的分解起著一定的作用。藥用膠原酶是從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中提取、純化并精制而得的白色或類白色無菌凍干粉針生物制劑，用于水解結(jié)締組織中的膠原成分，其藥動學特點是需要金屬鋅作為輔助因子參與酶解過程。膠原酶目前臨床主要用于Dupuytren 氏病。Dupuytren 氏病是一種手掌內(nèi)膠原纖維病理性增生的疾病，膠原纖維的進行性增生形成掌心結(jié)節(jié)和病理性鍵索，造成關(guān)節(jié)攣縮，嚴重影響手掌功能。局部注射膠原酶，可降解手掌內(nèi)異常增生的膠原纖維，松解指掌關(guān)節(jié)，改善手掌功能［7－8］。膠原酶在心血管疾病的應(yīng)用尚未見其他報道。

3 膠原酶軟化CTO 內(nèi)纖維瘢塊的實驗研究

3.1 實驗室級別膠原酶軟化CTO 內(nèi)纖維瘢塊，促進導引鋼絲通過CTO 實驗研究 實驗室級別膠原酶(Collagenase Type1A，Sigma) 是從溶組織芽孢桿菌發(fā)酵而來，是包括膠原酶、非特異蛋白酶、梭菌蛋白酶、中性蛋白酶和氨基肽酶在內(nèi)的多種酶的混合物。分子量在68 ～130KDa 為一般用途的膠原酶。將一直徑3.0mm 的Over－the－wire (OTW) 球囊導管在X 線導引下送至髂總動脈，用2 根常規(guī)0.014 的PTCA 導引鋼絲(Wizdom ［Cordis］和Choice PT ［Boston Scientific］) 分2 次試圖通過CTO。如鋼絲未通過CTO 且造影未發(fā)現(xiàn)血管撕裂，CTO 病變則被選入膠原酶應(yīng)用研究。迅速將導管送至CTO 近端，將球囊打至4 個大氣壓，以形成1 個在球囊頂端和CTO 近端之間的封閉空間。移去鋼絲，沿OTW 導管將含Type1A 原酶(100μg 或450μg) 總量為1.5ml 的液體注入此空間。最初10例，我們在 膠原酶注入1h 后立即進行導引鋼絲穿過試驗，均已失敗告終?；谶@樣的經(jīng)驗，以后的鋼絲通過試驗均在膠原酶注入72h 后進行。總共45 個CTO 病變，隨機行對照組(24例) 或膠原酶組(21 例) 試驗。一期試驗： 膠原酶100μg，n=14； 二期試驗： 膠原酶450μg，n =31。當血管造影顯示導引鋼絲成功穿過CTO 病變，或出現(xiàn)較大的血管撕裂或持續(xù)25min 仍不能通過病變，則終止介入手術(shù)。然后處死動物，取出股動脈標本，做HE 和MOVAT 染色，行組織病理分析。另有6 個CTO 病變在注射膠原酶(450μg) 后24h，取出標本行膠原酶活性和膠原片段生化分析。實驗結(jié)果表明，用藥72h后，膠原酶治療組導引鋼絲通過CTO 病變的成功率顯著高于對照組(62% VS 29%，P =0.028) ； 血管壁撕裂的發(fā)生率兩組并無顯著性差異。組織病理顯示導引鋼絲成功通過的CTO橫切面內(nèi)瘢塊被破壞而且血液充溢開通的血管腔(見圖2) 。內(nèi)彈力膜撕裂的比率，膠原酶治療組和對照組無顯著性差異(15 ±17%和20 ±24%，P=0.28) 。在450μg 膠原酶治療組可見皮膚表面輕度發(fā)紺。明膠酶譜顯示有明顯增多的92－和82－kDa 的裂解帶，表明僅在膠原酶治療組有MMP－9 酶前體及活性成分(見圖3A) ； 蛋白免疫印記分析表明膠原降解片段也明顯高于對照組(見圖3B) 。本實驗結(jié)果提示局部注射膠原酶，能在不破壞動脈深層結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，有效的降解CTO 內(nèi)纖維瘢塊的膠原成分，促進導引鋼絲通過CTO 病變［4］。

3.2 臨床級別膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的有效性和毒性研究 為了能將膠原酶在CTO 再通治療中的應(yīng)用推向臨床，我們對一種臨床級別的膠原酶的有效性和毒性進行了臨床前研究。這種更為純化的膠原酶 (CorCordase，Advance Biofactures，Lynbrook，NY) 包括兩種成分，膠原酶ABC1 和膠原酶ABC2，均從溶組織芽孢桿菌分離純化而來，都是約含1 000 個氨基酸的多肽鏈，前者分子量為115KD，后者為110KD［9－10］，兩種成分之間無交叉免疫反應(yīng)。這種純化的膠原酶對各種膠原纖維都有一定水解活性，其強度是實驗室級別膠原酶的38 倍，而且已經(jīng)用于包括Dupuytren 氏病在內(nèi)的臨床實踐。依上文所述同樣方法，局部注射150μg 純化膠原酶24h 后，導引鋼絲順利通過所有17 例CTO 病變，其中2 例出現(xiàn)血管撕裂。毒性研究表明，動物股部皮膚有劑量依賴性的發(fā)紺出現(xiàn)。注射50μg 時無發(fā)紺出現(xiàn)，150μg 時皮膚輕度發(fā)紺，500μg 時則有嚴重皮膚發(fā)紺。組織病理并未發(fā)現(xiàn)血管壁結(jié)構(gòu)破壞。明膠酶譜顯示僅膠原酶治療組存在MMP－9 和MMP－2 酶前體及其活性成分；蛋白免疫印記分析表明膠原酶治療組較對照組有更高的MMP－1 蛋白和膠原降解成分［11］。

3.3 冠狀動脈內(nèi)注射膠原酶后的安全性研究 為了進一步了解膠原酶冠狀動脈內(nèi)注射后的安全性，我們向正常豬的冠狀動脈內(nèi)注射膠原酶Type1A，以期了解膠原酶對心臟的毒性反應(yīng)。在X 線引導下，將1 直徑2.0 ～2.5mm 的OTW 球囊導管沿0.014 導引鋼絲送至前降支第二對角支處，打開球囊至14 個大氣壓，冠狀動脈造影以確定冠狀動脈被完全阻斷，然后沿OTW 導管注入(50、100、250、400、600、800、1200、1600和3200μg) 的9ml PBS 液體。8min 后除去球囊導管，行冠狀動脈造影。分別于24h 或30d 后處死動物，取出心臟作病理切片，以觀察心肌出血，炎癥改變。冠狀動脈內(nèi)注射膠原酶24h后，除球囊擴張對血管壁造成的炎性反應(yīng)外，未見膠原酶對血管壁的破壞作用。對照組和低劑量治療組(600μg 以下) ，未見心肌有明顯變化。高劑量組(800 ～3600μg) ，心肌則有明顯的上皮出血，主要集中在右室和左室心尖。顯微鏡下，600～1200μg 組已出血輕度灶性出血，1600 ～3200μg 則出現(xiàn)中度出血。所有標本均有輕度的炎性細胞浸潤。到30d 時，心肌的出血現(xiàn)象已消失，代之以心內(nèi)膜下心肌纖維化(見圖4) 。

3.4 膠原酶軟化CTO 內(nèi)纖維瘢塊的臨床研究 經(jīng)過近10 年不懈的實驗研究，膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的應(yīng)用實踐終于于2009 年從實驗室走向臨床。一期膠原酶劑量安全性研究已經(jīng)完成。共20 例患者，所有患者均經(jīng)至少1 次的PCI 血管再通治療但均以失敗告終。患者分4 組，每組5 人； 所用純化的臨床級別膠原酶劑量分別為300μg、600μg、900μg 和1200μg。膠原酶經(jīng)OTW 球囊導管或fine－cross 導管送至CTO 病變處，持續(xù)約30min。24h 后，患者回到導管室，行PCI 血管再通治療。膠原酶治療后導引鋼絲通過病變的成功率是75%。由于放支架時造成的側(cè)支缺血，有3 例出現(xiàn)了非ST 段抬高的心肌梗死。3 個月后CT 血管造影顯示無后續(xù)并發(fā)癥，膠原酶治療成功病例支架仍然開通； 心絞痛癥狀明顯緩解［12］。

CTO 病變目前是介入心臟病學需要攻克的主要障礙之一，應(yīng)用膠原酶軟化CTO 纖維瘢塊的臨床研究以及多中心的國際合作正在逐步展開。也許在不遠的將來膠原酶對CTO 纖維瘢塊的軟化，就會成為CTO、PCI 血管再通治療的主要手段之一。

圖1 人冠狀動脈CTO 和家兔股動脈CTO 模型病理橫切面Figure 1 Pathological transverse coronary CTO and rabbit femoral artery CTO model

圖2 導引鋼絲成功通過CTO 橫切面的組織病理Figure 2 Tissue pathology of guide wire successfully passed the CTO transverse

圖3 膠原酶治療組與對照組的比較Figure 3 Comparison of collagenase treatment group and control group

圖4 冠狀動脈內(nèi)注射膠原酶后的變化Figure 4 Change of intracoronary injection of collagenase

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