安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 張寬朝 全明吉

黑豆，為豆科植物的種子，亦稱烏豆、黑大豆?，F(xiàn)代藥理研究證實，黑豆含有豐富的蛋白質、卵磷脂、脂肪、維生素以及黑色素、煙酸等，具有抗氧化、增強免疫力、抗炎、抗癌、防止脂質過氧化等重要功能（王敏等，2008；陳穎和徐巍，2008）。多酚氧化酶（PPO）是自然界分布較為廣泛的一種氧化還原酶，是一類含銅元素的金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質體中。本試驗以黑豆為試驗材料，對其中的多酚氧化酶進行了分離純化及酶學特性研究，以期為進一步研究多酚氧化酶的基本特性和調控黑豆的加工過程提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 黑豆：廬州黑豆，市售，經(jīng)剝皮后用粉碎機破碎，備用。DE-52為Whatman分裝；透析袋為Usa分裝；PEG-20000為Ameresco分裝；硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、PVP、EDTA、Tris、氫氧化鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍G-250等均為國產(chǎn)分析純。SP-722E分光光度計（上海光譜儀器有限公司），TGL-20M臺式高速冷凍離心機 （湘儀離心機儀器有限公司），MC99-3自動液相色譜分離層析儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑豆多酚氧化酶酶活性測定 取2支試管，一支作為空白管加入3 mL 1/15 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，另一支加2 mL 1/15 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，1 mL 0.1%鄰苯二酚，搖勻。2支試管同時于50℃恒溫預熱5 min，分別加入0.5 mL酶液，立即計時，搖勻。準確恒溫反應15 min，迅速取出于420 nm處比色讀取 OD值 （張雅芬等，2005）。PPO活力單位定義為 ：每分鐘OD值變化0.001為一個酶的活力單位（U）。

1.2.2 黑豆多酚氧化酶的分離純化

1.2.2.1 粗酶液的提取 稱取粉碎后黑豆粉，按照1∶2質量比例分別加入經(jīng)過預冷（4℃）的 1/15 mol/L、pH為5.8、6.8和7.6的磷酸緩沖液 （內(nèi)含5%的PVP），于4℃下浸提2 h，用4層脫脂紗布過濾，濾液于4℃下10000 r/min，離心15 min，上清液即為多酚氧化酶粗酶液。

1.2.2.2 硫酸銨分級沉淀 邊攪拌邊向粗酶液中加入固體硫酸銨粉末至飽和度為30%，4℃、10000 r/min離心10 min，棄去沉淀，繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨至飽和度為80%，4℃、靜置過夜，4℃、10000 r/min離心 15 min，傾倒上清液，留沉淀備用。

1.2.2.3 透析脫鹽 上述沉淀復溶于10 mL 1/150 mol/L、pH為 6.8的磷酸緩沖液，將復溶后的酶液裝入已處理好的透析袋中，4℃以蒸餾水透析6 h后，于1/150 mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液脫鹽透析過夜。

1.2.2.4 DE-52層析純化 DE-52依照常規(guī)處理，裝層析柱，1/150 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液平衡過夜，將經(jīng)飽和硫酸銨分級沉淀并已透析脫鹽的酶液上樣，以0至1 mol/L NaCl，pH 6.8磷酸緩沖液梯度洗脫，自動部分收集器收集洗脫液，每管5 min。合并收集相鄰酶活性峰，PEG20000濃縮備用。

1.2.3 酶學特性研究

1.2.3.1 反應進程曲線的制作 按1.2.1酶活測定體系加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預熱5 min，加入酶液，分別于 50 ℃恒溫準確反應 5、10、20、25、30、40 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.2 最適pH 按1.2.1酶活測定體系，分別加入 pH 5.6、6.2、6.8、7.4、8.0 的磷酸鹽緩沖液，0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預熱5 min，加入酶液，分別于50℃恒溫準確反應15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.3 最適溫度 按1.2.1酶活測定體系，分別加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預熱5 min，加入酶液，分別于20、30、40、50、60 ℃恒溫準確反應 15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.4 最適底物濃度 按1.2.1酶活測定體系，加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，再分別加入0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.1%、0.2%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預熱5 min，加入酶液，于50℃恒溫準確反應15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.5 金屬離子對黑豆多酚氧化酶活性的影響按1.2.1酶活測定體系，分別加入1.0、1.5、3.0 mg/mL MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、CaCl2，pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液，0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預熱5 min，加入酶液，于50℃恒溫準確反應15 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.3.6 抑制劑對黑豆多酚氧化酶活性的影響按1.2.1酶活測定體系，分別加入1.0、1.5、3.0mg/mL含抗壞血酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、Na2SO3， pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，0.1%鄰苯二酚，搖勻，于50℃恒溫預熱5 min，加入酶液，于50℃恒溫準確反應15 min，迅速取出測定酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同pH抽提法對黑豆PPO活性的影響由圖1可知，在提取溫度，浸提時間和PVP含量相同的情況下，pH對酶活的影響較大。分析抽提酶液， 酶活性依次為 pH 6.8＞pH 5.8＞pH 7.6，pH 6.8時PPO活性最大，因此，后續(xù)試驗過程中選取pH 6.8磷酸緩沖液作為黑豆多酚氧化酶的提取溶液。

2.2 黑豆多酚氧化酶的DE-52層析 取黑豆粉末，經(jīng)30%～80%飽和硫酸銨分級沉淀，1/150mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液透析脫鹽過夜，上DE-52陰離子交換層析柱，以0至1mol/L NaCl，pH 6.8磷酸緩沖液（200 mL+200 mL）進行梯度洗脫，結果見圖2。從圖2可知，30%～80%硫酸銨分級沉淀初步純化的黑豆PPO，經(jīng)離子交換層析分離，僅有1個活性峰。

2.3 PPO的反應進程曲線 從圖3可知，在30 min以內(nèi)，PPO催化反應的酶活力與反應時間基本成線性關系。在反應30 min后，PPO反應進程曲線逐漸變平。這是因為隨著催化反應的進行，底物鄰苯二酚在逐漸減少，而產(chǎn)物的生成量逐漸增多，對PPO酶的反饋抑制作用逐步加強，從而酶促活力增加速度下降。

2.4 黑豆多酚氧化酶的最適pH pH對PPO的影響一般是通過改變酶的構象實現(xiàn)的。pH不但影響酶活性基團的解離，也會影響底物的解離。由于PPO是含銅酶，pH較高或者較低都會導致Cu2+的解離及蛋白質的變性，從而使PPO失去活性。有研究報道，不同植物的PPO或同一植物基因家族中不同PPO基因的表達產(chǎn)物，其最適pH可能有所不同。蓮藕中的PPO以鄰苯二酚為底物，最適pH為7.0（黃建韶和田宏現(xiàn)，2002）。而煙草中的PPOI以鄰苯二酚為底物，最適pH為7，PPOII的最適pH為6（戴亞等，2001）。由圖4可知，當pH為5.5～6.8時，隨著pH的逐漸增加，黑豆PPO的活性逐漸增強，當pH達到6.8時，PPO酶活性達到最高峰，然后，隨著pH的繼續(xù)增加，酶的活性逐漸減弱。因此，可知黑豆PPO的最適pH為6.8，在近中性范圍內(nèi)。

2.5 黑豆多酚氧化酶的最適溫度 從圖5可知，在20～50℃，酶活性隨著溫度的升高而逐漸上升，50℃時酶活性最高。隨著溫度的進一步升高，酶活性呈不斷下降的趨勢。這是因為溫度對酶反應的影響可歸納為兩個方面，一是酶作為一種生物催化劑，隨著溫度的升高，活化分子數(shù)增多，催化效率增加，酶促反應速度加快；另一影響在于酶促反應具有其生物學性質，反應溫度升高到一定程度，隨著酶蛋白的變性程度加深，酶會逐步喪失其催化活力。因此，在20～50℃，可能是第一種效應起主導作用，適度提高溫度，利于對酶朝著有利于底物發(fā)生作用的催化構象轉變，而此后繼續(xù)升高溫度則會破壞酶的活性構象，酶活性不斷下降。因此，黑豆PPO的最適反應溫度是50℃，與番石榴最適反應溫度是50℃結果相一致（楊昌鵬等，2006）。

2.6 底物濃度對酶活力的影響 從圖6可知，隨著底物濃度增大，PPO酶活力逐漸增高，但當?shù)孜餄舛鹊竭_一定值時 （0.1%），隨著底物濃度的增加，PPO酶活力增高幅度降低。其原因在于當?shù)孜餄舛容^低時，酶蛋白處于過量狀態(tài)，而隨著底物濃度逐漸增加，越來越多的底物與酶分子結合，此時，酶將逐漸飽和，直到達到最大飽和值。因此，以鄰苯二酚做反應底物時，黑豆PPO最適反應底物濃度為0.1%。

2.7 金屬離子對黑豆多酚氧化酶活性的影響以磷酸鹽緩沖液內(nèi)含金屬離子作為反應體系，測定不同金屬離子對黑豆PPO活性的影響，結果見圖7和圖8。因Cu2+作為PPO酶的輔因子，參與酶的組成，易在分離提純過程中丟失，所以，在供試濃度范圍內(nèi)，低濃度外源Cu2+的加入，能夠激活黑豆PPO酶活性。從圖7可知，可提高酶活性至225%，而高濃度Cu2+則抑制PPO酶活性。由圖8可知，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+對酶活性均有抑制作用， 在供試濃度范圍內(nèi)，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+對PPO活性的抑制均達到50%以上，而Ca2+對酶活性的抑制為50%左右。

2.8 抑制劑對黑豆多酚氧化酶活性的影響 從圖9可知，在供試濃度范圍內(nèi)，抗壞血酸、EDTA、Na2SO3均對黑豆PPO活性具抑制作用?？箟难釋PO活性的抑制作用其機理可能在于維生素C作為PPO輔基銅離子的螯合劑與銅離子發(fā)生鍵聯(lián)，導致PPO失活；或者是因為維生素C作為醌類物質的還原劑，將PPO酶促褐變反應的中間產(chǎn)物鄰二醌還原成鄰二酸，阻止了醌類物質進一步自發(fā)聚合形成褐色物質因而抑制了褐變，但是，抗壞血酸本身容易發(fā)生非酶褐變。EDTA屬于金屬離子螯合劑，對PPO活性抑制作用的機制是因為EDTA具有較強的Cu2+螯合能力，能夠很大程度上螯合PPO中的Cu2+，因此形成穩(wěn)定的螯合物而抑制了PPO的活性。Na2SO3對多酚氧化酶反應體系的抑制作用可能基于兩個方面，一方面Na2SO3能不可逆地與醌加成，而生成無色的產(chǎn)物，從而抑制了PPO的褐變，另一方面，Na2SO3可能還有漂白和抑制微生物的作用（程建軍等，2002）。在生產(chǎn)實踐中，抗壞血酸為生物有機體本身所固有的營養(yǎng)成分，其安全性較高，所以可以作為理想的工業(yè)用抑制劑，而對于亞硫酸鈉而言，則要充分考慮其在生物制品中的殘留問題（楊昌鵬等，2006；程建軍等，2002）。

3 結論與討論

試驗對黑豆中的多酚氧化酶進行了抽提，分離純化，并進行了酶學特性的研究，結果表明，黑豆多酚氧化酶的最適反應pH為6.8，最適反應溫度為50℃，最適底物濃度為0.1%，在供試濃度范圍內(nèi)，高濃度 Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+及抗壞血酸、EDTA、Na2SO3均是其抑制劑。

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