東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 楊 瓊 孫滿吉＊ 黃立敏 王 寅 朱繼紅 徐春桃 李建平

秸稈的粗纖維含量高，粗蛋白質(zhì)很低，導(dǎo)致其質(zhì)地粗硬，適口性差，不易消化，家畜采食量低，飼用價(jià)值不高 （李延云，2006；馮仰廉和張子儀，2001；Kayongo，1993）。 利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素，具有條件溫和、產(chǎn)物產(chǎn)率高和無二次污染等特點(diǎn) （徐廣等，2007； 張紅蓮，2004），因此，發(fā)展和利用產(chǎn)高活性纖維素酶的微生物對(duì)纖維素原料進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化是一種有效的資源利用途徑（肖舸等，2004；Tomme，1995）。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)存在大量的細(xì)菌、纖毛蟲和真菌，能夠利用飼料中的纖維素、半纖維素，進(jìn)行分解和發(fā)酵，轉(zhuǎn)化為宿主的營養(yǎng)物質(zhì)和能量（劉敏雄，1991）。因此，本試驗(yàn)以玉米秸稈為主要原料，采用體外培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵方法，旨在從奶牛瘤胃液中分離篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，最終為高效利用秸稈資源提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基 （100 mL）：CMC-Na 1.0 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 1.01 g，MnSO45×10-5g；蛋白胨 1.0 g，酵母膏 1.0 g，pH 6.4 ～ 6.8。

分離篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g，K2HP041 g，NaN033 g，MgSO40.5 g，瓊脂 17 g，蒸餾水l000 mL，pH 6.4～6.8；斜面活化保藏培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 17 g，蒸餾水 1000 mL，pH6.4～ 6.8。

玉米秸稈培養(yǎng)基：玉米秸稈粉3 g，蒸餾水100 mL（固體培養(yǎng)則不加水），pH自然。

1.1.2 溶液 配制3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH=6.0），1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.5%羧甲基纖維素鈉底物溶液，0.5%微晶纖維素底物溶液，0.5%水楊苷底物溶液。

1.2 方法

1.2.1 鮮瘤胃液的采集以玉米秸稈為粗料預(yù)飼東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地的4頭已裝置永久瘤胃瘺管的奶牛，預(yù)飼期為 2周。 晨飼（06∶00）后 2 h，于 4頭瘺管牛瘤胃內(nèi)上下左右不同位點(diǎn)采集足量瘤胃液，混合并用兩層紗布過濾，灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的保溫瓶中，立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回試驗(yàn)室。

1.2.2 富集培養(yǎng)取1 mL鮮瘤胃液接種至已滅菌的富集培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)20 h。

1.2.3 菌株的初篩取富集后的培養(yǎng)液做梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別涂布篩選平板，倒置恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，分離出能夠旺盛生長，并有明顯透明水解圈的菌株。

1.2.4 菌株的復(fù)篩挑取透明圈最大的11株菌，先在分離篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)劃線純化培養(yǎng)。再將純化后的菌株進(jìn)行斜面活化保藏及富集培養(yǎng)20 h并計(jì)數(shù)。取富集培養(yǎng)后的11株菌的菌液10 mL，分別接入玉米秸稈培養(yǎng)基中，準(zhǔn)確記錄玉米秸稈粉的重量，每株菌3個(gè)重復(fù)，厭氧恒溫培養(yǎng)60 h，另做一個(gè)空白對(duì)照組。60 h時(shí)將玉米秸稈培養(yǎng)物用定量濾紙過濾，60℃烘干回潮后稱重，通過測定處理后的玉米秸稈粉的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維選出對(duì)玉米秸稈纖維分解率最高的一株瘤胃菌。

1.2.5 菌株的保藏將選出的菌株在平板上連續(xù)劃線純化培養(yǎng)40 h，然后接入含斜面活化保藏培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)40 h后放入4℃冰箱中保藏。

1.2.6 菌株的鑒定 用接種環(huán)挑取少許新鮮的菌絲涂布于干凈玻片上的一滴無菌水或是蒸餾水中，風(fēng)干固定，染色。用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的形態(tài)特征。

1.2.7 不同條件下的酶活測定

1.2.7.1 接種量對(duì)酶活影響 接重量按2%，4%、6%、8%、10%、12%、14%接種至玉米秸稈固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含水6 mL，培養(yǎng)60 h后測酶活。

1.2.7.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活影響 培養(yǎng)條件與1.2.7.1中相同，接種量為1.2.7.1中所得最優(yōu)接種量，分別在 24、36、48、60、72 h 時(shí)測酶活，每個(gè)重復(fù)3次。

1.2.7.3 不同氮源對(duì)酶活力影響 培養(yǎng)條件與1.2.7.2 中相同，以（NH4）2SO4、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏作為氮源。固體培養(yǎng)基分別添加上述氮源（總氮量為0.4%），培養(yǎng)后測酶活，每個(gè)重復(fù)3次。

1.2.7.4 吐溫80含量對(duì)酶活的影響 培養(yǎng)條件與1.2.7.3 相同，在含吐溫分別為0.5%、1%、1.5%、2%的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后測酶活，每個(gè)重復(fù)3次。

1.2.8 酶活力測定

1.2.8.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 至 6 支刻度試管中，蒸餾水定容至2 mL，另取一支試管加2 mL蒸餾水做空白調(diào)零，往各試管中加2mol/LNaOH 溶液 0.5 mL，DNS 試劑 1 mL，沸水浴5 min后立即冷卻，定容至10 mL，測其540 nm紫外光吸收值。以紫外光吸收值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8.2 粗酶液的制備 將固體酶曲中加入30 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁?0℃水浴鍋中水浴10 min后過濾，濾液即為粗酶液。

1.2.8.3 測定方法 纖維素酶活力測定：將0.5%微晶纖維底物懸浮液及粗酶液水浴預(yù)熱至50℃，取 4 支 10 mL 刻度試管，編號(hào)為 1、2、3、4，何 4 支試管里加1.5mL底物溶液，并向1號(hào)試管里加1mL DNS溶液以鈍化其中的纖維素酶，作為空白調(diào)零，另3支試管加0.5 mL粗酶液，50℃水浴振蕩10 min，立即取出加入0.5 mL 2mol/LNaoH溶液，并向2，3，4號(hào)試管內(nèi)加入1 mL DNS溶液，沸水浴5 min后迅速冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，540 nm下測定吸光度。

內(nèi)切葡聚糖酶活力測定：將0.5%羧甲基纖維素鈉及粗酶液預(yù)熱至50℃，方法同上。

纖維二糖苷酶活力測定：將0.5%水楊苷底物溶液及粗酶液預(yù)熱至50℃，方法同上。

木聚糖酶活力測定：將0.5%木聚糖底物溶液及粗酶液預(yù)熱至50℃，方法同上。 酶活定義為在上述條件下，1 mg酶每分鐘催化底物水解成葡萄糖微克數(shù)定為一個(gè)活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選 通過剛果紅篩選培養(yǎng)基從瘤胃液中篩選出11株透明圈較大的纖維分解菌。并將11株菌進(jìn)行了純化。復(fù)篩時(shí)以處理后的玉米秸稈粉的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維為指標(biāo)，選出對(duì)玉米秸稈纖維分解率最高的一株瘤胃菌，該菌的編號(hào)為Q3。該菌株20 h富集培養(yǎng)液的菌數(shù)為2.3×1015∕mL。玉米秸稈經(jīng)該菌處理后NDF含量從84.72%降至77.35%，Q3菌株使玉米秸稈中的NDF含量降7.37個(gè)百分點(diǎn)，ADF的含量從51.85%降低至44.78%，降低7.07個(gè)百分點(diǎn)。

2.2 菌株的初步鑒定 本次試驗(yàn)所篩出的Q3菌柱在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上的菌落邊緣整齊，呈圓形，為乳白色，不透明，濕潤，微隆起。顯微鏡下觀察菌體形態(tài)為短桿狀，革蘭氏染色結(jié)果顯示為革蘭氏陽性菌。V.P反應(yīng)為陰性，甲基紅反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陽性。菌株能水解淀粉和利用葡糖糖產(chǎn)酸，不能利用檸檬酸鹽。結(jié)合以上特征，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版，該菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.3 不同條件下酶活測定 圖1為DNS法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=1.5308x+0.0198。

2.4 接種量對(duì)酶活的影響 由圖2可知，當(dāng)接種量為8%時(shí)，所測酶活的整體水平較高，此時(shí)纖維二糖苷酶酶活為3719 U/g，內(nèi)切葡聚糖酶酶活為3380 U/g，纖維素酶酶活為4098 U/g。原因可能是接種量低于8%時(shí)，營養(yǎng)過剩，菌絲體徒長，產(chǎn)酶滯后；接種量高于8%時(shí)，則菌絲體增長迅速，后期營養(yǎng)不良，且溫度升高，不利于產(chǎn)酶。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響 由圖3可知，培養(yǎng)60 h時(shí)，各項(xiàng)酶活指標(biāo)整體水平較高，具體數(shù)值與2.4一致。原因可能是，前60 h菌體正迅速增殖，隨著纖維菌的增殖產(chǎn)酶量增大，但菌體增殖的同時(shí)有害代謝物的排除也增加，60 h后有害代謝物的增加使菌體進(jìn)入衰亡期，從而不利于產(chǎn)酶。

2.6 不同氮源對(duì)酶活的影響結(jié)果 由圖4可知，NH3NO3為氮源時(shí)，酶活的總體水平較高，此時(shí)纖維二糖苷酶活為5265 U/g，內(nèi)切葡聚糖酶活為5684 U/g，纖維素酶活為5862 U/g。由此可確定本試驗(yàn)中，該菌的最優(yōu)氮源為NH3NO3。

2.7 吐溫80含量對(duì)酶活的影響 由圖5可知，當(dāng)吐溫80的含量為1%時(shí)，所測酶活整體水平較高，此時(shí)纖維二糖苷酶活為6512 U/g，內(nèi)切葡聚糖酶活為595 1U/g，纖維素酶活為8578 U/g。表明一定含量的吐溫80能提高細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，從而有利于酶排除細(xì)胞體外，但吐溫含量過高可能會(huì)影響菌體的正常代謝，從而產(chǎn)酶功能受到影響，導(dǎo)致酶活降低。

3 結(jié)論

3.1 經(jīng)過初篩和復(fù)篩，選出對(duì)玉米秸稈纖維分解能力最強(qiáng)的一株瘤胃菌，編號(hào)為Q3，根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化特征將菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

3.2 試驗(yàn)表明，此菌株最適宜產(chǎn)酶條件為：接種量8%、氮源NH3NO3、吐溫含量1%，培養(yǎng)時(shí)間60h。

3.3 該菌所產(chǎn)胞外纖維素酶，分離過程不需要破碎細(xì)胞，便于酶的分離提純，可大大減少工序，降低成本。

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