劉美鳳 谷靈靈 蔣利榮 周惠

(1.華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510640;

2.華南理工大學廣東省綠色化學產(chǎn)品技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510640)

番石榴(Psidium guajava)為桃金娘科番石榴屬植物.番石榴葉資源豐富，化學成分多樣，不僅有止瀉、降血壓［1］、保護心臟［2］的作用，還具有明顯的降糖作用，且臨床療效顯著［3-5］.番石榴葉單方制劑“消渴降糖膠囊”已收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第十五冊［6］，用于糖尿病及其并發(fā)癥的臨床防治.但該制劑具體的活性成分和作用機制尚未明確.

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、過氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα)、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶是與治療糖尿病相關(guān)的靶標.PTP1B通過對胰島素受體激酶(IRK)或IRK活性片段的磷酸化絡(luò)氨酸殘基的去磷酸化對胰島素信號傳導(dǎo)起負向調(diào)節(jié)作用［7］，從而阻斷胰島素與受體結(jié)合過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］;PPARγ可增強胰島素與其受體結(jié)合的信號傳導(dǎo)，提高胰島素的敏感性，從而有效降低血糖;PPARα是脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，廣泛用于肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的研究中［9］;α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是抑制碳水化合物水解的酶，可減緩葡萄糖的吸收，從而降低餐后高血糖.目前常用的降糖藥有磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、葡萄糖苷酶抑制劑、苯甲酸衍生物類.Fu等［10］從番石榴葉中得到了3種新二醛雜源萜類化合物Psidial A、Psidial B、Psidial C，發(fā)現(xiàn)雖然其對癌細胞活性不明顯，但是在濃度為10μmol/L時，Psidial B、Psidial C對 PTP1B的抑制率分別達到61.7%、38.8%.這兩種化合物均含有3，5-二醛基倍半萜結(jié)構(gòu)，從而提示番石榴葉二醛雜源萜類化合物中可能含有降糖活性更強的成分或增效物質(zhì).文中采用Accelrys Discovery Studio 2.5中基于CHARMm力場的柔性對接程序CDOCKER［11］，以從番石榴葉和桉葉中分離得到的13個二醛雜源萜［12-14］為配體，PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶為受體，進行降糖活性成分的虛擬篩選，從分子水平上了解小分子化合物的降糖機理，為番石榴二醛類降糖藥的設(shè)計和結(jié)構(gòu)修飾提供理論參考，以期為降糖藥物的研發(fā)提供指導(dǎo)和幫助.

1 實驗材料與方法

1.1 小分子配體的準備

圖1 番石榴葉和桉葉中分離得到的13種二醛雜源萜類化合物的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 13 dialdehyde meroterpenoid compounds from Psidium guajava and Eucalyptus globulus leaves

首先在畫圖軟件ChemDraw Ultra 7.0中畫出13種二醛雜源萜的結(jié)構(gòu)［10，12-14］(見圖 1)，直接拷貝到Discovery Studio(DS)中.由于配體數(shù)目較多，還要考慮對映異構(gòu)體等因素，所以采用DS中的Prepare Ligand處理該體系，通過此操作不僅可以對小分子的構(gòu)象進行能量優(yōu)化處理，產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，加氫，還可以產(chǎn)生異構(gòu)體.13種二醛雜源萜化合物經(jīng)過這樣的處理后產(chǎn)生了53種用于對接的配體分子.

1.2 蛋白文件的處理

文中所用 PTP1B(2HNP)、PPARγ(3PRG)、PPARα(3FEI)、α-淀粉酶(1PPI)、α-葡萄糖苷酶(2ZEO)的晶體結(jié)構(gòu)均源自布魯克海文蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，括號中所示均指代碼.對上述蛋白的處理如下:使用DS打開下載的晶體三維結(jié)構(gòu)模型，除去水分子;去除蛋白多構(gòu)象，補充非完整的氨基酸殘基，為蛋白添加極性氫;最后給蛋白施加CHARMm力場得到用于對接的蛋白.

1.3 分子對接

對接過程如下:定義蛋白為受體，尋找受體中可能的結(jié)合部位，最大的結(jié)合位點被用于和配體做對接.當對接完成后，分子對接的結(jié)果根據(jù)對接能大小進行打分，對接能是小分子和蛋白的結(jié)合能，該值越小，證明受體與配體的對接親和力越大，即預(yù)測小分子與受體結(jié)合的活性越高;另外通過DS軟件分析得到配體與受體的氫鍵數(shù)，洞察那些對配體結(jié)合有重要貢獻的氨基酸殘基.

2 結(jié)果與討論

2.1 配體與受體的對接結(jié)果

配體和PTP1B對接完成后，共產(chǎn)生了70個對接位點，詳見表1.

表1 配體與PTP1B的對接結(jié)果Table 1 Docking results of PTP1B with ligands

Euglobal Iia的親和活性最強，其分子對接效果見圖2(a).由二維平面圖可知，配體Euglobal Iia二醛結(jié)構(gòu)中的一個氧原子與受體的Ser216殘基之間存在明顯的氫鍵作用，距離為0.23 nm.苯環(huán)上的羥基與Lys116存在明顯的氫鍵作用，距離為0.18nm.苯環(huán)自身和Arg221形成鍵，距離為0.54nm.另外，配體Euglobal Iia延伸至受體內(nèi)部，被氨基酸殘基包圍，與酶分子形成了較強的疏水作用.

配體與PPARγ分子對接完成后，共產(chǎn)生了70個對接位點，詳見表2.

表2 配體與PPARγ的對接結(jié)果Table 2 Docking results of PPARγ with ligands

Euglobal Ib的親和活性最強，其分子對接效果見圖2(b).由二維平面圖可知，配體Euglobal Ib處于 Leu330、Ile326、Ala292、Ile341、Tyr327 等的包圍之中.這可能是因為這些殘基與配體的相互作用增強了配體與受體的結(jié)合能力，從而使該配體的活性提高.

配體與PPARα對接完成后，共產(chǎn)生了60個對接位點，詳見表3.

表3 配體與PPARα的對接結(jié)果Table 3 Docking results of PPARα with ligands

Euglobal Ic的親和活性最強，其分子對接效果見圖2(c).由二維平面圖可知，配體Euglobal Ic側(cè)鏈吡喃環(huán)上的氧原子與Ala333形成氫鍵，成鍵距離為0.23nm.

圖2 Euglobal Iia、Euglobal Ib、Euglobal Ic 的分子對接效果圖(單位:nm)Fig.2 Molecular docking charts of Euglobal Iia，Euglobal Ib and Euglobal Ic(Unit:nm)

2.2 配體與受體的氫鍵數(shù)

通過DS軟件還可觀察對接位點數(shù)與受體每個氨基酸殘基形成的氫鍵數(shù).配體在和PTP1B對接時，氨基酸殘基 Lys116、Lys120、Arg221、Tyr46 具有重要貢獻，它們與70個對接位點形成的氫鍵數(shù)較多，分別是20、16、16和8;配體在和 PPARγ對接時有70個位點，氨基酸殘基 Glu343、Ser342、Ser289、Cys285與這些對接位點形成的氫鍵數(shù)較多，分別是32、27、19和9;配體在和PPARα對接時有60個位點，氨基酸殘基 Ala333、Thr279、Cys276、Tyr334 與這些對接位點形成的氫鍵數(shù)較多，分別是33、20、10和8.

2.3 討論

通過分子模擬的方法，篩選番石榴葉中能與PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶對接的二醛雜源萜化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn):

(1)雜源萜類化合物與 PTP1B、PPARγ、PPARα有對接位點，而與 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均無對接位點.這可能是由于 α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的結(jié)合空腔過于狹窄，而DS比較適合球形空腔的分子對接，因此沒有找到對接位點.

(2)13個二醛雜源萜類成分與PTP1B、PPARγ、PPARα對接時分別產(chǎn)生了共70、70、60個對接位點，但番石榴葉中的 Diguajadial、Guajadial、Psidial A、Psiguadial A以及EuglobalⅢ、EuglobalⅤ與 PTP1B、PPARγ、PPARα、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶無結(jié)合位點.分析其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，苯二醛所連側(cè)鏈比較復(fù)雜，因此無結(jié)合位點，這可能與其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、空間位阻大有關(guān)系.

(3)由表1可知，Psidial B、Psidial C和 PTP1B有對接位點，這在一定程度上佐證了 Fu等［10］對Psidial A、Psidial B、Psidial C抑制PTP1B的研究.

(4)來源于桉葉中的Euglobal Ib、Euglobal Ic、Euglobal Iia這3種小分子物質(zhì)與上述5種受體的結(jié)合活性均較高，這與其結(jié)構(gòu)簡單、空間位阻小有一定關(guān)系，同時也佐證了文獻所述的桉葉粗提物對兔具有降血糖的功效［15］.另外，通過分析 Euglobal Ib、Euglobal Ic、Euglobal Iia的結(jié)構(gòu)，可發(fā)現(xiàn)這3種小分子物質(zhì)是同分異構(gòu)體，只是手性有差別.由二維平面圖分析可知，配體中的二醛結(jié)構(gòu)和吡喃環(huán)在對接的過程中具有重要作用，與受體活性部位間通過鍵、疏水作用和氫鍵作用相互結(jié)合，可為開發(fā)番石榴二醛類降糖藥的結(jié)構(gòu)設(shè)計和結(jié)構(gòu)修飾提供參考.

(5)通過第 2.2 節(jié)中配體與 PTP1B、PPARγ、PPARα形成的氫鍵數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)一些氨基酸殘基在配體與受體的結(jié)合中具有重要貢獻，這對新藥靶點的發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計有重大意義.Thomas等［16］的研究也認為，在患者出現(xiàn)糖尿病癥狀之前，血液中酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸5種氨基酸水平均出現(xiàn)了異常升高的現(xiàn)象.可見，尚需進一步研究與糖尿病密切相關(guān)的氨基酸，這對糖尿病的預(yù)防和治療將有一定的幫助.

3 結(jié)語

文中采用虛擬篩選的方法研究了13個二醛雜源萜類化合物與糖尿病相關(guān)靶標的相互作用，發(fā)現(xiàn)Euglobal Iia、Euglobal Ib、Euglobal Ic 具有較強的結(jié)合能力，這和它們所含的二醛結(jié)構(gòu)以及吡喃環(huán)有關(guān)，它們可以和周圍的氨基酸殘基通過氫鍵或疏水作用相互結(jié)合.因此，在對降糖藥物的立體結(jié)構(gòu)改造中可引入二醛結(jié)構(gòu)或吡喃環(huán)，提高其與糖尿病靶標對接的親和性.分子模擬方法針對性強，是一種較好的藥物篩選手段，是新藥研究和開發(fā)的有效途徑之一，將會在今后的藥物研究中繼續(xù)發(fā)揮其重要作用.

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