趙謀明 張遠(yuǎn)紅 崔春 源博恩

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

大豆蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，是食品工業(yè)中重要的蛋白質(zhì)資源.大豆蛋白食品消費(fèi)量逐年增長(zhǎng)，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的有效利用和加工性能一直是大豆蛋白深加工領(lǐng)域發(fā)展的主題.研究表明，大豆蛋白酶解可產(chǎn)生一系列具有生理活性的多肽，從而達(dá)到提高大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的效果［1］.

大豆蛋白主要由 β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)組成.7S是由非共價(jià)鍵穩(wěn)定的三聚體糖蛋白，研究表明，7S熱不穩(wěn)定且易被酶水解［2］.11S是由二硫鍵連接酸性亞基和堿性亞基而成的六聚體，分子高度壓縮、結(jié)構(gòu)緊密，對(duì)蛋白酶的酶解作用具有較強(qiáng)的抵抗力［3-4］，是限制大豆蛋白酶解效率的關(guān)鍵因素.因此，必須考慮對(duì)大豆蛋白的11S組分進(jìn)行前處理，使其致密的結(jié)構(gòu)變得松散，以利于高效酶解［5］.前處理手段一般包括物理手段、化學(xué)手段和酶法手段.有研究發(fā)現(xiàn)，11S組分在酸性條件下會(huì)發(fā)生亞基解離［6］，緊密結(jié)構(gòu)展開，從而有利于酶解的進(jìn)行［7］.基于胃蛋白酶作用最適 pH 值為 1.5 ～2.2，對(duì)11S具有選擇性優(yōu)先水解的獨(dú)特效果［7-8］，文中結(jié)合化學(xué)法和酶法對(duì)大豆蛋白進(jìn)行前處理，先采用胃蛋白酶處理大豆蛋白，然后用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，針對(duì)酶解產(chǎn)物的十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、蛋白回收率、水解度、抗氧化性以及分子質(zhì)量分布進(jìn)行了一系列的分析，以期為功能性大豆肽的生產(chǎn)提供理論和方法上的指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 主要原料

主要原料如下:低溫脫脂豆粕，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;胃蛋白酶(酶活600～1000 U/mg)，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;堿性蛋白酶，奧博星生物技術(shù)有限公司提供(測(cè)定酶活33.6萬U/g);復(fù)合蛋白酶，諾維信公司提供(測(cè)定酶活17.3萬U/g);熒光物質(zhì)Sodium Fluorescein、自由基產(chǎn)生劑AAPH，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品.電泳試劑為電泳級(jí)，其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備如下:320-S數(shù)顯pH計(jì)，瑞士梅特勒－托利多公司生產(chǎn);DYY-Ⅲ28A電泳槽，北京六一儀器廠生產(chǎn);紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);KDN-40消化爐，上海新嘉電子有限公司生產(chǎn);KDN-2C型蛋白質(zhì)測(cè)定儀，上海纖檢儀器有限公司生產(chǎn);Amersham蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng)，Amersham中國(guó)有限公司生產(chǎn);Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo Scientific公司生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆蛋白溶液的制備

采用堿溶酸沉法［9］提取大豆蛋白.稱取一定量的低溫脫脂豆粕與去離子水按1∶15(體積比)的比例混合，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，浸提1h后在6000r/min下離心10min去除殘?jiān)?，?mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，酸沉后6000r/min下離心10min，所得沉淀加5倍體積的去離子水復(fù)溶，配成大豆蛋白溶液，備用.

1.3.2 酶解方法

將上述配好的大豆蛋白溶液平均分成兩份.一份先用胃蛋白酶在pH=2.0、37℃、加酶量3‰(酶/底物)條件下酶解到最適時(shí)間后立即調(diào)節(jié)pH值至8.5，穩(wěn)定30 min后，加1%的堿性蛋白酶在50℃下酶解;另一份則不經(jīng)過胃蛋白酶前處理，直接調(diào)節(jié)pH值至8.5，加1%的堿性蛋白酶在50℃下酶解，酶解過程中用2 mol/L NaOH維持pH值恒定.取樣時(shí)間為 0、1、2、4、8、12、22、24 h，酶解至終點(diǎn)時(shí)將酶解液置于100℃水浴中加熱10 min滅酶，冷卻至室溫后于10000r/min下離心20min，將所得上清液稱重后冷凍以備檢測(cè).按照相同步驟，用復(fù)合蛋白酶代替堿性蛋白酶，酶解溫度為50℃，pH值為8.0，測(cè)定復(fù)合蛋白酶的酶解效果.

1.3.3 SDS-PAGE 分析

SDS-PAGE 參照 Laemmli［10］的方法.分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%.電泳前將已和樣品緩沖液混合的樣品煮沸5min，并在10000r/min下離心5min，取15μL上清液進(jìn)樣.凝膠電泳于恒流下進(jìn)行，濃縮膠中電流為40 mA，進(jìn)入分離膠后增至80mA，凝膠染色及脫色后，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理.

1.3.4 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定

用凱氏定氮法測(cè)定大豆蛋白酶解上清液中蛋白氮含量［11］，按下式計(jì)算蛋白回收率:

式中:X1為大豆蛋白酶解上清液蛋白含量，%;X2為大豆蛋白溶液蛋白含量，%;m為大豆蛋白酶解上清液質(zhì)量，g;M為大豆蛋白酶解液質(zhì)量，g.

1.3.5 水解度的測(cè)定

水解度(DH)的測(cè)定采用OPA法［12］:

其中，h為斷裂肽鍵數(shù)，總肽鍵數(shù)htot(大豆蛋白)=7.8.

1.3.6 酶解液抗氧化活性評(píng)價(jià)

酶解液抗氧化活性評(píng)價(jià)采用ORAC值法.ORAC 值的測(cè)定參照 Hernández等［13］的方法.將待測(cè)樣品溶于75mmol/L磷酸鹽緩沖液中配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的溶液，取20 μL加入96孔熒光板微孔中，再添加20μL磷酸鹽緩沖溶液(75 mmol/L)及20μL熒光溶液(70 nmol/L)，在37℃下預(yù)置15 min后，加入12mmol/L AAPH 140μL啟動(dòng)反應(yīng)，以激發(fā)波長(zhǎng)485nm、發(fā)射波長(zhǎng)538nm進(jìn)行測(cè)定，每2min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止，即設(shè)為2 h.ORAC值是將熒光衰退曲線的保護(hù)面積與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)(Trolox)的保護(hù)面積相比得出，以每克肽中的Trolox當(dāng)量(μmol)表示.

1.3.7 酶解液的分子質(zhì)量分布測(cè)定

采用Amersham蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng)測(cè)定大豆蛋白酶解液分子質(zhì)量分布.凝膠滲透色譜(GPC)條件如下:Superdex-peptide，10/300-GL玻璃柱，洗脫液為0.25mmol/L NaCl，pH=7.2 的磷酸鹽緩沖液，流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm.標(biāo)準(zhǔn)肽樣品與洗脫液體積擬合方程為lgG=－0.0578V+4.6289(r2=0.99)，式中l(wèi)gG為標(biāo)準(zhǔn)肽相對(duì)分子質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)，V為洗脫液體積.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的平均值，并使用Origin Pro 8.0 作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE 圖譜分析

圖1所示為不同酶解時(shí)間下的SDS-PAGE圖譜.從圖1中可以看出:隨著酶解的進(jìn)行，大豆蛋白11S組分的亞基條帶逐漸消失，到2 h時(shí)完全消失，表明此時(shí)11S組分全部被胃蛋白酶酶解;而隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，7S亞基條帶變化不明顯，說明胃蛋白酶對(duì)7S敏感性較低.因此，實(shí)驗(yàn)中選用胃蛋白酶酶解2h作為前處理?xiàng)l件.

圖1 胃蛋白酶酶解大豆蛋白不同時(shí)間下的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of soy protein hydrolysates hydrolyzed by pepsin with different time

圖2所示為大豆蛋白酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜.從圖2中可以看出，胃蛋白酶酶解2 h后，11S亞基條帶亮度顯著減弱，而7S亞基條帶變化不明顯.這與圖1的結(jié)果相符.從條帶7－10和16－19可以看出，單獨(dú)使用堿性蛋白酶酶解時(shí)，酶解主要作用在7S和11S的酸性亞基上，酶解速度很快，酶解1h已經(jīng)降解幾乎全部的目標(biāo)亞基，但對(duì)堿性亞基作用較弱，酶解24h后依然有堿性亞基存在，酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量最大在20ku左右;而單獨(dú)使用復(fù)合蛋白酶酶解時(shí)，酶解速度較慢，酶解主要作用于7S，對(duì)11S的酸性亞基有較弱作用.使用胃蛋白酶酶解2h作為前處理，在很大程度上提高了這兩種蛋白酶的酶解效率.從條帶3－6和12－15可以看出，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量最大在14ku左右，酶解24h后幾乎所有的亞基被酶解;而復(fù)合蛋白酶酶解時(shí)，不僅7S被酶解，11S也被酶解完全，酶解8h后，幾乎所有的大豆蛋白亞基被分解.因此，胃蛋白酶前處理可以提高大豆蛋白的酶解效果，特別是對(duì)堿性蛋白酶的協(xié)同作用較強(qiáng).

圖2 大豆蛋白酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of soy protein hydrolysates

2.2 胃蛋白酶前處理對(duì)大豆蛋白回收率的影響

圖3給出了不同酶解處理對(duì)大豆蛋白回收率的影響.由圖3(a)可知，胃蛋白酶酶解2h的樣品蛋白回收率達(dá)到了56.8%，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，大豆蛋白發(fā)生亞基解離，蛋白緊密結(jié)構(gòu)展開，在胃蛋白酶的作用下11S被迅速分解.繼續(xù)用堿性蛋白酶水解，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白回收率不斷提高，24h時(shí)達(dá)到95.4%，與單酶酶解相比，蛋白回收率提高了39.9%.圖3(b)中復(fù)合蛋白酶單獨(dú)酶解1h的樣品由于水解程度比較低，在滅酶后離心分離時(shí)未能離心出上清液，因而，無法準(zhǔn)確測(cè)得其蛋白回收率.圖3(b)中復(fù)合蛋白酶酶解亦有與圖3(a)相同的趨勢(shì)，24h時(shí)回收率達(dá)到72.2%，蛋白回收率與單酶水解相比提高了19.4%.這表明，胃蛋白酶前處理可顯著提高這兩種酶的作用效果，特別是對(duì)堿性蛋白酶作用效果的增強(qiáng)更為明顯.

圖3 不同酶解處理對(duì)大豆蛋白回收率的影響Fig.3 Effect of different enzymatic treatment on soy protein recovery

2.3 胃蛋白酶前處理對(duì)大豆蛋白水解度的影響

圖4給出了不同酶解處理對(duì)大豆蛋白水解度的影響.從圖4可以看出，經(jīng)過胃蛋白酶處理2 h后大豆蛋白水解度達(dá)到2.8%，說明胃蛋白酶酶解過程中大豆蛋白部分肽鍵斷裂，釋放出一些肽段或游離氨基酸，這與Kong等［14］的研究結(jié)果相似.從圖中還可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白水解度不斷增大.單獨(dú)使用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)大豆蛋白酶解24h后，水解度分別達(dá)到17.0%和11.3%.而經(jīng)過胃蛋白酶處理2 h后再用這兩種蛋白酶進(jìn)行酶解，可提高大豆蛋白水解度，分別達(dá)到23.1%和12.2%，與未使用胃蛋白酶前處理相比分別提高了35.9%和8.0%;其中復(fù)合蛋白酶酶解水解度提高不顯著，這可能與該酶作用的特異性有關(guān).胃蛋白酶前處理后水解度提高的原因是:pH=2.0條件下，大豆蛋白發(fā)生亞基解離，在胃蛋白酶作用下，部分肽鍵斷開，分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的酶作用位點(diǎn)，從而有利于大豆蛋白的進(jìn)一步酶解，增強(qiáng)了酶解效率和酶解敏感性.對(duì)比圖4(a)和4(b)可知，堿性蛋白酶的作用效果明顯優(yōu)于復(fù)合蛋白酶.

圖4 不同酶解處理對(duì)大豆蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of different enzymatic treatment on degree of hydrolysis of soy protein

2.4 胃蛋白酶前處理對(duì)大豆蛋白抗氧化活性的影響

ORAC值法測(cè)定抗氧化活性的作用原理是一種經(jīng)典的通過抑制氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)過程終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng).ORAC值法具有高度的靈敏性［15-16］，其自由基來源為偶氮類化合物AAPH熱分解產(chǎn)生的過氧自由基，這些自由基與生命現(xiàn)象中的自由基具有高度的一致性.文中利用ORAC值法評(píng)價(jià)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性.

圖5所示為不同酶解處理對(duì)大豆蛋白酶液抗氧化活性的影響.從圖5中可以看出，酶解產(chǎn)物的抗氧化能力均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì).這是因?yàn)槊附膺^程中某分子質(zhì)量段的肽段具有較強(qiáng)的抗氧化能力，酶解前期隨著這部分分子質(zhì)量的肽段不斷增多，抗氧化性提高，而酶解后期隨著這部分分子質(zhì)量的肽段逐漸被降解成更低分子質(zhì)量的肽段或游離氨基酸，抗氧化性下降.這與任嬌艷等［17］的研究結(jié)果相似.未經(jīng)酶解處理的大豆蛋白的ORAC值只有165.2，而經(jīng)過胃蛋白酶處理2 h后的樣品，其ORAC值分別提高到431.7和407.4(見圖5).這說明胃蛋白酶處理所得產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性.使用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行單酶酶解的樣品，抗氧化能力最強(qiáng)時(shí)都出現(xiàn)在12 h左右，分別達(dá)到778.5和715.4.而經(jīng)過胃蛋白酶前處理后再用這兩種蛋白酶進(jìn)行酶解，產(chǎn)物ORAC值都比未經(jīng)過前處理的要高，最大值出現(xiàn)在8h處，達(dá)到1078.6和794.6，與單酶水解相比分別提高了38.5%和11.1%，這說明胃蛋白酶前處理可以提高大豆蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性.同時(shí)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物抗氧化性要高于復(fù)合蛋白酶的酶解產(chǎn)物，這可能與酶作用的特異性有關(guān).因此，選擇堿性蛋白酶進(jìn)一步酶解對(duì)增加大豆蛋白抗氧化性具有較好效果.

圖5 不同酶解處理對(duì)大豆蛋白酶解液抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of different enzymatic treatment on ORAC value of soy protein hydrolysates

2.5 大豆蛋白酶解液的分子質(zhì)量分布

從表1可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子組分(分子質(zhì)量大于10ku)逐漸減少，小分子組分(分子質(zhì)量小于5ku)逐漸增多;且經(jīng)過胃蛋白酶前處理的樣品，其低分子質(zhì)量肽段的含量明顯高于單酶酶解的樣品.表1中復(fù)合蛋白酶單酶水解1h的產(chǎn)物由于未分離出上清液而未測(cè)得其分子質(zhì)量分布.胃蛋白酶水解2h后分子質(zhì)量小于5ku的組分含量達(dá)到44.1%，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下胃蛋白酶水解了11S，產(chǎn)生了一定量的小分子組分.繼續(xù)用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解，大分子組分(分子質(zhì)量大于10ku)含量不斷減少，從29.1%分別下降到5.5%和9.0%，而小分子組分(分子質(zhì)量小于5ku)逐漸增多，在24h時(shí)含量分別達(dá)到85.4%和78.6%.這說明，用這兩種酶繼續(xù)酶解可使大豆蛋白進(jìn)一步降解.同時(shí)，與單酶酶解相比，經(jīng)過胃蛋白酶前處理的產(chǎn)物中分子質(zhì)量大于10ku的組分明顯降低，而分子質(zhì)量小于5 ku的組分顯著增加(在24h時(shí)分別增加了7.6%和17.6%).這表明，胃蛋白酶前處理能促進(jìn)大豆蛋白的進(jìn)一步酶解.

表1 不同酶解處理產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of hydrolysates by different enzymatic treatment

3 結(jié)論

(1)胃蛋白酶前處理可使大豆蛋白回收率和水解度顯著增加，提高大豆蛋白對(duì)堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶的酶解敏感性，這說明胃蛋白酶與堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶具有協(xié)同增效作用，特別是對(duì)堿性蛋白酶的提高效果更明顯.

(2)胃蛋白酶前處理后的酶解產(chǎn)物ORAC值(即抗氧化值)得到提高，最高可達(dá)到1078.6，這說明，胃蛋白酶前處理可提高酶解產(chǎn)物中大豆肽的抗氧化活性.

(3)對(duì)酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳分析和分子質(zhì)量分布分析可知，胃蛋白酶前處理可加快酶解過程，有利于小分子肽的生成.

［1］李榮和.大豆新加工技術(shù)原理與應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1999:40-57.

［2］Iwabuchi S.Thermal denaturation of β-conglycinin ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39(1):27-32.

［3］胡愛軍，鄭捷.大豆蛋白酶解技術(shù)比較［J］.精細(xì)化工，2005，22(6):461-463.Hu Ai-jun，Zheng Jie.Comparison of enzymatic hydrolysis technologies of soybean protein ［J］.Fine Chemical Engineering，2005，22(6):461-463.

［4］Fisher A V.A review of the technique of estimating the composition of livestock using the velocity of ultrasound［J］.Computers and Electronics in Agriculture，1997，17(10):217-231.

［5］Tang S H，Navam S.Protein extraction from heat-stabilized defatted rice bran.1 physical processing and enzyme treatments［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(25):7444-7448.

［6］源博恩，趙強(qiáng)忠，趙謀明.酸性條件下高壓均質(zhì)對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(8):79-82.Yuan Bo-en，Zhao Qiang-zhong，Zhao Mou-ming.Effects of high-pressure homogenization in acid condition on the structure and functional properties of soybean proteins［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33(8):79-82.

［7］Kazunobu T.Improvement of the physicochemical properties of soybean proteins by enzymatic hydrolysis［J］.Food Science and Technology Research，2009，15(4):381-388.

［8］劉曉毅，薛文通，胡小蘋，等.酶解法專一性去除大豆7S球蛋白中的 α-亞基［J］.食品科技，2005，8(8):16-18.Liu Xiao-yi，Xue Wen-tong，Hu Xiao-ping，et al.Special removal α-subunit of 7S globulin from soybean by enzymatic hydrolysis［J］.Food Technology，2005，8(8):16-18.

［9］Luo Donghui，Zhao Qiangzhong，Zhao Mouming，et al.Effect of limited proteolysis and high-pressure homogenisation on structural and functional characteristics of glycinin ［J］.Food Chemistry，2010，122(1):25-30.

［10］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 ［J］.Nature，1970，227(5259):680-685.

［11］趙新淮，馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測(cè)定［J］.食品科學(xué)，1994，1(11):65-67.Zhao Xin-huai，F(xiàn)eng Zhi-biao.The measurement of the degree of protein hydrolysates［J］.Food Science，1994，1(11):65-67.

［12］Nielsen P M，Petersen D，Dambmann C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis［J］.Journal of Food Science，2001，66(5):642-646.

［13］Hernández L B，Amigo L，Recio I，et al.ACE-inhibitory and radical-scavenging activity of peptides derived from beta-lactoglobulin f(19-25).Interactions with ascorbic acid［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(9):3392-3397.

［14］Kong Xiangzhen，Zhou Huiming，Qian Haifeng.Enzymatic preparation and functional properties of wheat gluten hydrolysates［J］.Food Chemistry，2007，101(2):615-620.

［15］Prior R L，Wu X L，Schaich K.Standardized methods for the determination of antioxidiant capacity and phenolics in foods and dietary supplements［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(10):4290-4302.

［16］續(xù)潔琨，姚新生，栗原博.抗氧化能力指數(shù)(ORAC)測(cè)定原理及應(yīng)用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(8):1015-1021.Xu Jie-kun，Yao Xin-sheng，Li Yuan-bo.Oxygen radical absorbance capacity assay and its application ［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，2006，22(8):1015-1021.

［17］任嬌艷，鄭賽晶，劉百戰(zhàn)，等.花生抗氧化肽的制備及其在卷煙濾嘴中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(9):1084-1089.Ren Jiao-yan，Zheng Sai-jing，Liu Bai-zhan.Preparation of antioxidant peptides from peanut protein and their application as cigarette tip additives［J］.Modern Food Science and Technology，2011，27(9):1084-1089.