楊慧林 王坤 廖瑜玲 王斌 林影 潘力

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006)

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，與枯草芽孢桿菌的種屬同源性較高，其基因組序列已于2007年公布［1］.目前，解淀粉芽孢桿菌廣泛用于生產(chǎn)核苷及多聚氨基酸等，如肌苷、鳥苷及 γ-聚谷氨酸［2-4］.此外，廣泛運(yùn)用的淀粉酶［5］和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶［6］也都來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌.

在大腸桿菌和枯草桿菌中，葡萄糖主要是通過磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(PTS)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)［7-8］.磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由ptsI基因編碼的EI、ptsH基因編碼的HPr及ptsG基因編碼的EIIGlc3種酶完成，其過程大致為磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸基團(tuán)通過EI和HPr傳遞給經(jīng)EIIGlc運(yùn)輸至胞內(nèi)的葡萄糖，從而完成葡萄糖的轉(zhuǎn)移.在大腸桿菌中，ptsG和ptsHI位于基因組的不同位置，而在枯草桿菌中，ptsGHI組成一個(gè)操縱子表達(dá).Escalante等［9］通過敲除大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，提高了莽草酸的產(chǎn)量;韓聰?shù)龋?0］構(gòu)建了一株大腸桿菌ptsG基因缺陷株，其最高菌密度為野生型菌株的4.25倍.國(guó)內(nèi)外關(guān)于枯草芽孢桿菌磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究?jī)H有少數(shù)報(bào)道［7，11-12］，且至今未見關(guān)于解淀粉芽孢桿菌磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的報(bào)道.

文中通過溫敏型質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組雙交換的方法，敲除解淀粉芽孢桿菌XH7的ptsG和ptsHI基因，并研究其缺陷株生長(zhǎng)特性及鳥苷產(chǎn)率，以期為解淀粉芽孢桿菌磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)機(jī)制的研究及運(yùn)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

Escherichia coli Mach1T1購(gòu)于Invirtogen公司，Escherichia coli JM110來(lái)源于廣東省微生物菌株保藏中心，Bacillus amyloliquefaciens XH7由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;Escherichia coli TG1和質(zhì)粒pKS1(溫度敏感型復(fù)制子，Ermr，Kanr)由美國(guó)紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng).質(zhì)粒pKS2為pKS1的衍生質(zhì)粒(刪除了3個(gè)BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)).

1.1.2 主要試劑和儀器

FastDigestTM快速限制性內(nèi)切酶、FastAPTM熱敏感堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司;T4多聚核苷酸激酶、pSIMPLE-18 Eco R V/BAP載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;抗生素Amp、Kan購(gòu)自北京普博欣生物科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和KOD-Plus-Neo高保真性PCR酶購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司;葡萄糖濃度測(cè)定采用南京建成公司的葡萄糖檢測(cè)試劑盒;其它試劑均為分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10;LBG培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，葡萄糖20;LBS培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，山梨醇90;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨 10，酵母粉 10，味精 5，NaCl 5，腺嘌呤0.05，pH=7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 120，酵母粉16，(NH4)2SO415，KH2PO42，MgSO4·7H2O 4，味精10，CaCO325，pH值調(diào)節(jié)至6.5后滅菌，葡萄糖和CaCO3分消.大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，除含有溫敏型質(zhì)粒的大腸桿菌要置于30℃下培養(yǎng)外，其它均于37℃下培養(yǎng).

1.1.4 引物

引物P1與P2用于對(duì)pKS1質(zhì)粒進(jìn)行改造，消除pKS1上的3個(gè)BamHⅠ位點(diǎn);引物P3與P4、P5與P6分別用于PCR擴(kuò)增ptsG基因的左、右同源臂;引物P7與P8、P9與P10分別用于PCR擴(kuò)增基因ptsHI的左、右同源臂;引物P11與P12用于PCR鑒定ptsG基因缺陷突變株;引物P13與P14用于PCR鑒定ptsHI基因缺陷突變株.引物P1、P2的斜體部分為SmaⅠ和BglⅠⅠ酶切位點(diǎn)，其它引物的下劃線部分是方向重復(fù)序列，作為融合PCR擴(kuò)增的重疊區(qū)，具體引物序列見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers in the investigation

1.2 方法

1.2.1 溫敏型質(zhì)粒pKS2及ptsG和ptsHI基因敲除質(zhì)粒的制備

以質(zhì)粒pKS1為模板、P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一段含有紅霉素抗性基因的DNA片段.DNA片段連接pSIMPLE-18 Eco R V/BAP載體后用SmaⅠ和BglⅠⅠ雙酶切膠回收，pKS1質(zhì)粒用SmaⅠ和BamHⅠ雙酶切膠回收，利用BamHⅠ和BglⅠⅠ為同尾酶的特性，將兩片段連接成一個(gè)新的質(zhì)粒pKS2，此質(zhì)粒不含有Bam HⅠ位點(diǎn).pKS1的圖譜信息及引物設(shè)計(jì)位置如圖1所示.

圖1 溫敏型質(zhì)粒pKS1圖譜及引物P1與P2的位置Fig.1 Profile of temperature-sensitive plasmid pKS1 and positions of primers P1 and P2

以Bacillus amyloliquefaciens XH7的基因組為模板，以P3和P4、P5和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到ptsG基因的左、右同源臂，再分別以回收的左右同源臂為共同模板，以P3和P6為引物進(jìn)行重疊PCR得到ptsG基因的左右同源臂片段C1.線性片段C1經(jīng)磷酸化處理后，連接到經(jīng)SmaⅠ酶切及去磷酸化處理的線性化載體pKS2，最終構(gòu)建得到ptsG基因的敲除質(zhì)粒pKS2-ptsG;按相同的方法，以P7和P8、P9和P10為引物，構(gòu)建ptsHI基因的敲除質(zhì)粒pKS2-ptsHI.

1.2.2 ptsG和ptsHI基因的快速敲除及鑒定

ptsG和 ptsHI基因的快速敲除分4個(gè)步驟進(jìn)行:(1)參考文獻(xiàn)［13］中的方法制備 Bacillus amyloliquefaciens XH7電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞.(2)電轉(zhuǎn)化:取5μL敲除質(zhì)粒至100μL感受態(tài)細(xì)胞并混勻，冰浴后將混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的2mm電擊杯中，2500V、25μF、200 Ω電擊轉(zhuǎn)化，電擊完成后迅速加入1 mL LBS培養(yǎng)基，在30℃下，以130 r/min振蕩3 h培養(yǎng)后涂布Kan平板(5 mg/L)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.(3)誘導(dǎo)敲除:單菌落轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)過夜后涂布Kan平板(5 mg/L)并置于37℃下培養(yǎng)，長(zhǎng)出的即為發(fā)生同源重組單交換的轉(zhuǎn)化子;轉(zhuǎn)接單交換的轉(zhuǎn)化子到LB中，30℃下培養(yǎng)36h后，涂布到LB平板，置于37℃下培養(yǎng)12 h后隨機(jī)挑取平板中40個(gè)單菌落接種于Kan平板，選擇Kan平板上不生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定.基因敲除策略見圖2.(4)菌落PCR鑒定:以引物P11和P12進(jìn)行菌落PCR鑒定在Kan平板不生長(zhǎng)的ptsG敲除株，若PCR擴(kuò)增不出來(lái)，證明敲除成功，若能擴(kuò)增出來(lái)，說(shuō)明回復(fù)突變成野生型(WT);按同樣的原則，以引物P13和P14進(jìn)行菌落PCR鑒定ptsHI敲除株.

圖2 無(wú)標(biāo)記基因敲除策略Fig.2 Knockout strategy of markerless gene

1.2.3 菌體生長(zhǎng)曲線的繪制

分別挑取野生型的Bacillus amyloliquefaciens XH7、ptsG敲除株和ptsHI敲除株單菌落于10mL LB培養(yǎng)基上，37℃、200r/min下培養(yǎng)過夜后取100μL菌體轉(zhuǎn)接至10mL LB及LBG中，37℃、200r/min下繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定菌體密度，從而繪制出菌體生長(zhǎng)曲線.

1.2.4 鳥苷發(fā)酵及產(chǎn)量測(cè)定

分別挑取野生型的Bacillus amyloliquefaciens XH7、ptsG敲除株和 ptsHI敲除株單菌落于20 mL種子培養(yǎng)基上，37℃、200 r/min下培養(yǎng)至600 nm下光密度(D(600))約為5.0，然后取2mL接種至裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL擋板三角搖瓶中37℃、200r/min下培養(yǎng)66 h.培養(yǎng)結(jié)束后，用NaOH調(diào)至pH=10.0后沸水浴5min，離心取上清即為提取的鳥苷產(chǎn)物.鳥苷含量的測(cè)定采用HPLC法，具體條件見文獻(xiàn)［14］.

2 結(jié)果和分析

2.1 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及基因敲除

Shatalin等［15］利用溫敏型質(zhì)粒pKS1成功地敲除了Bacillus anthracis的racE1和racE2基因.文中用pKS1轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率極低.解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，而質(zhì)粒pKS1上有3個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)，因此，質(zhì)粒pKS1轉(zhuǎn)化進(jìn)入解淀粉芽孢桿菌后會(huì)被內(nèi)源的BamHⅠ限制性內(nèi)切酶降解.文中通過分子改造，消除了pKS1上的3個(gè)Bam HⅠ位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)化效率提高了1 000倍左右，轉(zhuǎn)化效率達(dá)每微克DNA 2.5×103.

ptsG基因和ptsHI基因的左、右同源臂通過融合PCR連接成一個(gè)完整的DNA片段(見圖3(a))，DNA片段經(jīng)過磷酸化處理后連接到pKS2質(zhì)粒的SmaⅠ位點(diǎn).按圖2所示方法敲除ptsG及ptsHI基因，經(jīng)PCR鑒定，鑒定引物為P3和 P6、P7和 P10、P11和P12、P13和P14，ptsG基因缺陷株用引物P3和P6能擴(kuò)增出約2 kbp的片段，用引物P11和P12不能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而ptsHI基因缺陷株用引物P7和P10能擴(kuò)增出約2 kbp的片段，用引物P13和P14不能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物(見圖3(b))，這說(shuō)明獲得的敲除株是正確的.

圖3 同源臂融合片段的構(gòu)建及基因缺陷株的PCR鑒定Fig.3 Construction of homologous arm fusion fragments and PCR identification of gene deficient strains

2.2 ptsG和ptsHI基因缺陷株及野生型菌株在LB和LBG中的生長(zhǎng)特性比較

在LB培養(yǎng)基中，ptsG及ptsHI基因缺陷株的生長(zhǎng)狀況與野生型(WT)菌株無(wú)明顯差異(見圖4(a))，其大約在10h時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)區(qū)，最高菌體密度約為8.0.由于LB培養(yǎng)基中基本不含葡萄糖，敲除ptsG和ptsHI對(duì)其菌體的生長(zhǎng)基本上沒有影響.

在含有2%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，ptsG和ptsHI基因缺陷株及WT菌株的生長(zhǎng)特性表現(xiàn)出較大差異.在LBG中，WT菌株的最高菌密度比其在LB中提高了50%，表明添加葡萄糖可以促進(jìn)解淀粉芽孢桿菌的生長(zhǎng);在LBG中，ptsG基因缺陷株的最高菌密度比其在LB中提高了90%，比WT菌株在LBG培養(yǎng)基中的最高菌密度提高了28%，這說(shuō)明敲除ptsG基因后，提高了解淀粉芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的利用效率，促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng);但是，ptsHI基因缺陷株的生長(zhǎng)狀況與其在LB中基本一致，這說(shuō)明敲除ptsHI基因阻斷了解淀粉芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的利用，ptsHI基因是葡萄糖利用的必需基因(見圖4(b)).從LBG培養(yǎng)基中殘余葡萄糖的濃度可以看出:WT菌株消耗葡萄糖的速度最快，當(dāng)培養(yǎng)至18 h左右時(shí)，葡萄糖基本耗盡;敲除ptsG基因降低了葡萄糖消耗速度，表明ptsG基因參與的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不是菌株葡萄糖吸收的唯一通道，還存在其它途徑可吸收利用葡萄糖;敲除ptsHI基因后，菌株不再吸收葡萄糖，因此其葡萄糖的濃度保持不變(見圖4(c))，從而造成ptsHI基因缺陷株的最高菌密度比WT菌株降低了約32%.

在解淀粉芽孢桿菌中，葡萄糖主要是通過磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)輸至胞內(nèi).ptsG編碼的酶EIIGlc是一種葡萄糖專一性的膜運(yùn)輸?shù)鞍?敲除ptsG基因后，并沒有完全阻斷解淀粉芽孢桿菌對(duì)葡萄糖的吸收，此時(shí)，葡萄糖仍可通過manP基因編碼的酶EIIMan運(yùn)輸至胞內(nèi)［16］.在含葡萄糖的培養(yǎng)基中，本研究發(fā)現(xiàn)ptsG基因缺陷株的最高菌密度比野生型菌株提高了28%，可能原因是敲除ptsG基因后，降低了葡萄糖的利用速度以及副產(chǎn)物的產(chǎn)生.與ptsG敲除菌比較，ptsHI敲除菌徹底阻斷了葡萄糖經(jīng)過PTS途徑入胞，在富含葡萄糖的LBG及發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度均較差，不利于菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成，此結(jié)果與周軍智等［10，17］的報(bào)道相一致.

圖4 ptsG及ptsHI缺陷株在LB及LBG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及葡萄糖消耗情況比較Fig.4 Comparison of growth curves and glucose concentration of ptsG and ptsHI deficient strains in LB and LBG mediums

2.3 ptsG和ptsHI基因缺陷株的鳥苷發(fā)酵及分析

按照第1.2.4節(jié)所述方法，對(duì)ptsG和ptsHI基因缺陷株及WT菌株進(jìn)行鳥苷發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵后用HPLC法檢測(cè)鳥苷產(chǎn)量，結(jié)果如表2所示.

表2 ptsG和ptsHI基因缺陷株及WT菌株的鳥苷產(chǎn)量及pH值Table 2 Guanosine production and pH value of ptsG and ptsHI genetic defect strains and wild-type strain

從表2可看出，敲除 ptsG基因后，鳥苷產(chǎn)量比WT菌株提高了約24%，而敲除ptsHI基因后，鳥苷產(chǎn)量比WT菌株降低了約82%.發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量達(dá)0.12g/mL，因此，敲除 ptsHI基因后會(huì)直接影響菌體對(duì)葡萄糖的利用，導(dǎo)致菌體缺乏碳源而無(wú)法持續(xù)生長(zhǎng).從發(fā)酵66h后的pH值也可看出，ptsHI缺陷株的pH值明顯高于野生型及ptsG缺陷株，這說(shuō)明發(fā)酵66h后，ptsHI缺陷株已發(fā)生自溶.

3 結(jié)語(yǔ)

解淀粉芽孢桿菌ptsG基因產(chǎn)物與大腸桿菌crr基因產(chǎn)物具有同源性，敲除ptsG基因后解除了解淀粉芽孢桿菌的分解代謝阻遏效應(yīng)(葡萄糖效應(yīng))，從而促使ptsG缺陷株在利用葡萄糖的同時(shí)能夠高效利用LB復(fù)合培養(yǎng)基中的其它碳源底物;另外，葡萄糖利用速率的降低有利于減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高了葡萄糖的利用效率.與野生型菌株相比，敲除ptsG基因后，菌體的最高密度更高，且平穩(wěn)期更長(zhǎng).文中通過鳥苷發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種特性的改變可以增加鳥苷的產(chǎn)量，但是提高的幅度不大.后續(xù)實(shí)驗(yàn)希望能夠敲除manP基因，看能否進(jìn)一步改變菌體的生長(zhǎng)特性，或者重構(gòu)葡萄糖的運(yùn)輸途徑，為構(gòu)建高效合成鳥苷的工程菌打下基礎(chǔ).

［1］Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，et al.Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillusamyloliquefaciens FZB42［J］.Nature Biotechnology，2007，25(9):1007-1014.

［2］Zhang G，Deng A，Xu Q，et al.Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208，a strain for industrial production of guanosine and ribavirin［J］.Journal of Bacteriology，2011，193(12):3142-3143.

［3］Geng W，Cao M，Song C，et al.Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens LL3，which exhibits glutamic acid-independent production of poly-gamma-glutamic acid［J］.Journal of Bacteriology，2011，193(13):3393-3394.

［4］Yang H，Liao Y L，Wang B，et al.Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens XH7，which exhibits production of purine nucleosides［J］.Journal of Bacteriology，2011，193(19):5593-5594.

［5］Yoo Y J，Cadman T W，Hong J，et al.Fed-batch fermentation for the production of alpha-amylase by Bacillus amyloliquefaciens［J］.Biotechnology and Bioengineering，1988，31(5):426-432.

［6］Newman M，Strzelecka T，Dorner L F，et al.Structure of restriction endonuclease Bam HⅠand its relationship to EcoRI［J］.Nature，1994，368(6472):660-664.

［7］Reizer J，Bachem S，Reizer A，et al.Novel phosphotransferase system genes revealed by genome analysis-the complete complement of PTS proteins encoded within the genome of Bacillus subtilis［J］.Microbiology，1999，145(Pt 12):3419-3429.

［8］Garcia-Alles L F，Navdaeva V，Haenni S，et al.The glucose-specific carrier of the Escherichia coli phosphotransferase system ［J］.European Journal of Biochemistry，2002，269(20):4969-4980.

［9］Escalante A，Calderon R，Valdivia A，et al.Metabolic engineering for the production of shikimic acid in an evolved Escherichia coli strain lacking the phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system ［J］.Microbial Cell Factories，2010，9:21.

［10］韓聰，張惟材，游松，等.大腸桿菌ptsG基因敲除及其缺陷株生長(zhǎng)特性研究［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2004，20(1):16-20.Han Cong，Zhang Wei-cai，You Song，et al.Knockout of the ptsG gene in Escherichia coli and cultural characterization of the mutants［J］.Chinese Journal of Biotech-nology，2004，20(1):16-20.

［11］Poncet S，Soret M，Mervelet P，et al.Transcriptional activator YesS is stimulated by histidine-phosphorylated HPr of the Bacillus subtilis phosphotransferase system ［J］.The Journal of Biological Chemistry，2009，284(41):28188-28197.

［12］Singh K D，Halbedel S，Gorke B，et al.Control of the phosphorylation state of the HPr protein of the phosphotransferase system in Bacillus subtilis:implication of the protein phosphatase PrpC ［J］.Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2007，13(1/2/3):165-171.

［13］Zakataeva N P，Nikitina O V，Gronskiy S V，et al.A simple method to introduce marker-free genetic modifications into the chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85(4):1201-1209.

［14］Sheremet A S，Gronskiy S V，Akhmadyshin R A，et al.Enhancement of extracellular purine nucleoside accumulation by Bacillus strains through genetic modifications of genes involved in nucleoside export［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2011，38(1):65-70.

［15］Shatalin K Y，Neyfakh A A.Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，245(2):315-319.

［16］Saier M H，Goldman S R，Maile R R，et al.Overall transport capabilities of Bacillus subtilis［M］∥Bacillus subtilis and Its Closest Relatives:from Genes to Cells.［S.l.］:ASM Press，2002:113-128.

［17］周軍智，鄒永康，戴紅梅，等.大腸桿菌ptsHIcrr操縱子的快速敲除及敲除菌生長(zhǎng)性能測(cè)定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37(8):1146-1152.Zhou Jun-zhi，Zou Yong-kang，Dai Hong-mei，et al.Onestep knockout of the ptsHIcrr operon in Escherichia coli and characterization of the mutant［J］.Microbiology China，2010，37(8):1146-1152.