譚美英 隆雪明 鄧云波 武深樹(shù)

(湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南 長(zhǎng)沙 410006)

氟喹諾酮類(fluoroquinolones，F(xiàn)QNS或FQS)藥物，屬于第三代喹諾酮類抗菌藥，該藥物具有吸收好，組織濃度高，半衰期長(zhǎng)，抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，已成為醫(yī)療和獸醫(yī)臨床上的常用藥物。我國(guó)明文規(guī)定不得在飼料中添加氟喹諾酮類藥物。為確保人民的身體健康，有效打擊飼料中非法使用獸藥的行為，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法，測(cè)定飼料中氟喹諾酮類的含量顯得尤為重要。目前，我國(guó)現(xiàn)有雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定、動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定等的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但還沒(méi)有飼料中氟喹諾酮類儀器檢測(cè)方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

本文建立了高效液相色譜對(duì)飼料中氟喹諾酮的測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682一級(jí)水的規(guī)定。甲醇：色譜純；乙睛：色譜純；氨水、磷酸、三乙胺、氫氧化鈉；達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星對(duì)照品（純度≥99.0%）；氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取達(dá)氟沙星對(duì)照品10.0 mg，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星（精確到0.1 mg）對(duì)照品各50 mg，用0.03 mol/l氫氧化鈉溶液溶解并定容到50 ml容量瓶中，于4℃冰箱內(nèi)貯存。氟喹諾酮工作液：用移液管分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相分別稀釋配成恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/ml，達(dá)氟沙星為 0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，微孔濾膜，混合型陰離子固相萃取柱（100 mg/3 ml），提取液:2%氨水水溶液；0.03 mol/l氫氧化鈉溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平：感量0.00001 g和0.0001 g；固相萃取裝置；旋渦混勻器；離心機(jī)；超聲波清洗機(jī)；pH計(jì)精度為0.02；高效液相色譜儀。

1.3 液相色譜條件

熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm；色譜柱：C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm，或性能類似的色譜柱；流動(dòng)相：緩沖溶液（0.05 mol/l磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4 ml，用水稀釋至1000 ml，用三乙胺調(diào)pH值至2.4）+乙睛=17+83(V+V)；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣5 g（精確到0.001 g），置于50 ml離心管中，準(zhǔn)確加入25 ml提取液，渦旋振蕩2 min，超聲提取10 min，于5000 r/min離心5 min，重復(fù)提取一次，合并上清液，旋渦混勻備用。將SPE柱依次用甲醇、2%氨水水溶液各3 ml活化，取上清液（配合飼料10.00 ml、預(yù)混料和濃縮料5.00 ml）過(guò)柱，用2%氨水水溶液、甲醇溶液各3 ml淋洗，抽干，用流動(dòng)相4.00 ml洗脫，收集洗脫液，并定容至5 ml,混勻后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配好的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別注入色譜儀，測(cè)定各濃度工作液的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 靈敏度的測(cè)定

分別稱取3份5.00 g空白配合飼料，按樣品處理方法測(cè)定，測(cè)得基線噪音值，按10倍信噪比計(jì)算，求得該方法的定量限。

1.7 回收率的測(cè)定

稱取5.00 g空白配合飼料，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得添加恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星的濃度為 1.0、2.0、4.0 mg/kg，達(dá)氟沙星為 0.2、0.4、0.8 mg/kg，每一濃度的樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù)，按樣品處理方法測(cè)定，用外標(biāo)法根據(jù)峰面積計(jì)算其含量和添加回收率。

2 結(jié)果與分析

空白飼料、陽(yáng)性添加飼料、氟喹諾酮對(duì)照品溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜

圖2 空白試樣中添加氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜

圖3 空白試樣中氟喹諾酮的色譜

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將在選定的條件下，做定量校準(zhǔn)曲線，以氟喹諾酮的濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及回歸系數(shù)

2.2 方法的檢出限

該方法恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星在飼料中的檢出限為1 mg/kg，達(dá)氟沙星為0.2 mg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

添加濃度恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星為1.0、2.0、4.0 mg/kg，達(dá)氟沙星為 0.2、0.4、0.8 mg/kg 時(shí)，測(cè)得平均回收率為75%～105%，變異系數(shù)≤10%。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)相關(guān)報(bào)道，可以選用磷酸緩沖鹽、乙酸乙腈、氨水乙腈、乙酸甲醇、氨水甲醇、氨水水溶液和乙酸水溶液進(jìn)行飼料中添加氟喹諾酮藥物的提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用2%氨水水溶液提取效果最好。

3.2 固相萃取柱的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用C18、SCX、MAX固相萃取小柱進(jìn)行回收率和凈化效果比較，本方法選用MAX固相萃取小柱凈化效果好，回收率能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

3.3 洗脫液的選擇

分別選用水、氨水水溶液、甲醇溶液淋洗，發(fā)現(xiàn)甲醇能洗脫部分氟喹諾酮類藥物，采用5%、10%、20%、50%、80%甲醇水溶液洗脫，用50%的甲醇水溶液效果最好，回收率高，能有效的除去部分極性雜質(zhì)。

4 結(jié)論

恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星在飼料中添加濃度為1.0、2.0、4.0 mg/kg時(shí)，測(cè)得平均回收率范圍分別為75.2%～103.2%，79.8%～103.9%，81.7%～104.3%，達(dá)氟沙星在飼料中添加濃度為0.2、0.4、0.8 mg/kg時(shí)平均回收率分別為79.6%～101.4%、78.6%～99.7%、85.4%～105.1%，變異系數(shù)范圍為4.51%～8.82%，4.63%～8.85%，4.49%～9.83%，定量限為0.05 mg/kg。方法的穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定。

8篇，刊略，需者可函索）