賈煥珍，魯玲玲，龔普盛，付越姣，趙春禮，段春禮，楊 慧

（首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京神經(jīng)科學(xué)研究所北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100069）

PINK1參與調(diào)節(jié)多巴胺的合成

賈煥珍，魯玲玲，龔普盛，付越姣，趙春禮，段春禮，楊 慧*

（首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京神經(jīng)科學(xué)研究所北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100069）

目的 探討PINK1基因?qū)Χ喟桶泛铣傻恼{(diào)節(jié)作用。方法 用高壓液相色（HPLC）電化學(xué)方法檢測多巴胺（DA）含量，用Western blots和Real-Time PCR法檢測DA合成限速酶酪氨酸羥化酶（TH）和多巴脫羧酶（DDC）的表達(dá)量，通過免疫共沉淀（Co-IP）和免疫組織化學(xué)染色觀察PINK1和TH之間是否存在相互作用。結(jié)果PINK1基因敲減后，細(xì)胞內(nèi)DA水平為5.356±0.536 μg/L，顯著低于對照組的11.630±1.559 μg/L（P＜0.05）;TH mRNA和蛋白的表達(dá)分別為0.371±0.140和0.195±0.062，顯著低于對照組的1.009±0.152和0.386±0.044（P＜0.05）;DDCmRNA和蛋白的表達(dá)分別為0.396±0.124和0.149±0.029，顯著低于對照組的1.100±0.070和0.323±0.037（P＜0.05）;免疫熒光化學(xué)檢測PINK1和TH存在共定位，Co-IP顯示PINK1和TH存在相互作用。結(jié)論P(yáng)INK1可以通過調(diào)控DA的合成酶TH和DDC的表達(dá)影響DA的合成。

PINK1;RNA干擾;酪氨酸羥化酶;MN9D細(xì)胞

帕金森?。≒arkinson's Disease PD）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，主要病理變化是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性和丟失，紋狀體多巴胺（dopamine，DA）含量降低，進(jìn)而引起運動功能障礙［1］。PINK1是已知與 PD相關(guān)的致病基因［2］，PINK1突變可以引起遺傳性 PD［3］，而且有研究表明PINK1與散發(fā)性PD亦有密切關(guān)系［4］。因此，研究PINK1的功能，對于理解PD的發(fā)生有重要意義。

在果蠅模型中，PINK1突變可以引起部分腦區(qū)酪氨酸羥化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）陽性神經(jīng)元的減少，以及DA含量的減少［5－6］。在斑馬魚模型中，PINK1功能缺失同樣可以引起TH陽性神經(jīng)元及 DA含量的下降［7－8］。同時 PINK1如何調(diào)控DA代謝沒有相關(guān)報道。多巴胺能神經(jīng)元的特性之一就是產(chǎn)生和分泌DA神經(jīng)遞質(zhì)。該遞質(zhì)釋放減少是導(dǎo)致PD癥狀的主要原因。因此，闡明PINK1與DA合成的關(guān)鍵限速酶TH之間的關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

動物:SD大鼠［首都醫(yī)科大學(xué)動物部提供，等級:SPF，許可證編號SCXK（軍）2007-004］。細(xì)胞:小鼠多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（MN9D細(xì)胞），由Novartis公司Bastian Hengerer博士惠贈。引物合成（上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測序部）;Wizard Plus Midipreps DNA Purification systems（Promega公司）;DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco公司）;RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）;TH，β-actin抗體（Sigma公司）;PINK1 抗體［9］，DDC 抗體 （Abcam 公司），Lipofectamine 2000，普通質(zhì)粒小抽提試劑盒（Qigen公司），HRP標(biāo)記的二抗購于KPL公司;熒光二抗購于Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MN9D細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行。

1.3 高壓液相色譜（HPLC）

MN9D細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，消化細(xì)胞，離心去上清，加入PBS洗2遍，細(xì)胞計數(shù)后，每組取5×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新離心管中，離心取上清，加入HPLC裂解液，進(jìn)行裂解，反復(fù)凍融2次，14 000 r/min，離心15 min后，取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

取正常培養(yǎng)的C57BL/6小鼠黑質(zhì)部位腦片（40 μm），用 PBS 洗 3 遍，每次10 min，然后用0.03%PBST處理15 min。用5%山羊血清室溫孵育1h，加入 anti-PINK1（1∶1 000）和 anti-TH 抗體（1∶10 000），4℃過夜，次日用 PBS洗3次，加入相應(yīng)的FITC標(biāo)記的羊抗兔（或鼠）免疫球蛋白抗體（1∶500），37℃避光孵育1 h，PBS沖洗 3 次，加入DAPI于37℃避光孵育5 min復(fù)染細(xì)胞核，PBS沖洗3次，封片后用共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.5 Western blot檢測

在MN9D細(xì)胞系中分別瞬時轉(zhuǎn)染無關(guān)序列（對照組）和PINK1-shRNA（shRNA組），轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine 2000，在轉(zhuǎn)染后48 h提取全細(xì)胞蛋白，選用RIPA蛋白裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，BCA法測蛋白濃度，SDS PAGE電泳，半濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉1 h，分別入 PINK1（1∶10 000）和 DDC（1∶1 000），TH（1∶10 000），β-actin（1∶5 000），4℃ 過夜。0.1%TBST洗膜 3次，入相應(yīng)辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔（或鼠）免疫球蛋白抗體中（1∶10 000），室溫孵育1 h，洗膜同前。加入化學(xué)發(fā)光液，于暗室化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。

1.6 免疫共沉淀（Co-IP）

取SD大鼠黑質(zhì)跟紋體組織，加入RIPA裂解液，勻漿，12 000 r/min離心，20 min，提全細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實驗。每個樣品加入5 μL相應(yīng)抗體（PINK1，TH，IgG）及1 mL Co-IP緩沖液，加入 IgG組作為空白對照，置于4℃旋轉(zhuǎn)孵育12 h后均加入Protein G Agarose beads，于4 ℃輕輕旋轉(zhuǎn)12 h，洗滌緩沖液漂洗后加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，95℃加熱5 min，然后離心取上清，進(jìn)行蛋白電泳。

1.7 Real-Time PCR檢測基因表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染PINK1shRNA于MN9D細(xì)胞中，利用Trizol一步法提取（參照試劑盒說明書）總RNA，以oligo（dT）為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。Real-Time PCR反應(yīng)條件:50℃ 2 min;95℃ 2 min;95℃15 s，退火15 s，72℃ 45 s，共 40 個循環(huán);72℃10 min。所用的引物為:小鼠β-actin上游引物:5'-AATCGTGCGTGACATCAAAGAG-3';下游引物:5'-GGCCATCTCCTGCTCGAA-3';小鼠 PINK1上游引物:5'-AGAAAACCAAGCGCGTGTCT-3';下游引物:5'-GGAAGCCCTGCCAGCAT-3';小鼠TH上游引物:5'-CGAGCTGCTGGGACACGTA-3';下游引物:5'-CT GGGAGAACTGGGCAAATG-3';小鼠 DDC上游引物:5'-CCGGCTAAAGGGCTCCAAT-3';下游引物:5'-TTTTGGCGCTGTTTATTCTTTG-3'。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 成功建立PINK1基因敲減的MN9D細(xì)胞模型

在shRNA組PINK1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于對照組。（P＜0.05）（圖1）。

2.2 PINK1基因敲減后，MN9D細(xì)胞中DA水平降低

shRNA組細(xì)胞DA含量為5.356±0.536 μg/L顯著低于對照組的11.63±1.559 μg/L（P＜0.05）。

2.3 PINK1基因敲減后，MN9D細(xì)胞中 TH的mRNA水平和蛋白水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)

在shRNA組TH mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于對照組（P＜0.05）（圖2）。

2.4 PINK1基因敲減后，MN9D細(xì)胞中DDC的mRNA水平和蛋白水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)

在shRNA組DDCmRNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于對照組（P＜0.05）（圖3）。

2.5 PINK1與TH在MN9D細(xì)胞存在共定位

PINK1與TH在MN9D細(xì)胞中存在共定位（圖4）。

2.6 PINK1和TH之間可能存在相互作用

用TH抗體可以免疫沉淀PINK1蛋白，兩者之間有相互作用（圖5）。

3 討論

PD的病理特征是多巴胺能神經(jīng)元的選擇性和進(jìn)行性丟失。PINK1突變不僅可以引起家族性PD而且與散發(fā)性的PD密切相關(guān)，那么PINK1突變是如何引起多巴胺代謝異常，機(jī)理尚不清楚。本實驗通過干擾PINK1基因的表達(dá)，成功建立干擾PINK1細(xì)胞模型。高壓液相結(jié)果顯示在PINK1shRNA組，DA水平顯著降低。這與之前的文獻(xiàn)報道結(jié)果相一致［11－12］。說明在本實驗?zāi)Ｐ椭蠵INK1參與調(diào)節(jié)多巴胺的生物合成。

圖1 用Real-time和western blot檢測PINK1的干擾效率Fig 1 The interference efficiencies of PINK1-shRNA on PINK1 were detected by Real-time PCR and western blot

圖5 PINK1與TH之間存在相互作用Fig 5 PINK1 associated with TH

DA合成過程中限速酶TH的活性和表達(dá)量的變化直接影響DA的變化，因此本實驗進(jìn)一步檢測PINK1干擾之后TH的水平，結(jié)果顯示TH無論是在mRNA水平還是蛋白水平均明顯降低，說明PINK1可能是從轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)TH的表達(dá)，使其活性發(fā)生改變，與文獻(xiàn)報道在果蠅［11］和斑馬魚［12］中干擾掉PINK1之后，DA水平和TH陽性神經(jīng)元明顯減低相一致，但是在轉(zhuǎn)基因鼠中，敲減PINK1之后，DA水平下降，TH陽性神經(jīng)元沒有明顯的降低［10］，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是由于轉(zhuǎn)基因鼠的代償機(jī)制，某些蛋白的代償作用使敲減PINK1的作用減弱，從而沒有引起明顯的表型，TH陽性神經(jīng)元沒有減少。

本研究同時檢測了DA合成過程中的另一個酶DDC的變化，發(fā)現(xiàn)其在mRNA和蛋白水平明顯降低。提示PINK1可能是通過同時影響DA合成過程中的兩個酶TH與DDC的表達(dá)，來調(diào)節(jié)DA合成，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制，是本研究下一步的重點。

此外，由于PINK1是一個絲蘇氨酸蛋白激酶，具有激酶的活性。而且也有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，Parkin是PINK1的底物，PINK1可以通過直接磷酸化Parkin影響其線粒體轉(zhuǎn)位，所以PINK1可能通過直接與TH相互作用，使TH磷酸化進(jìn)而影響其活性。本研究利用MN9D細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)PINK1和TH有共定位，同時Co-IP結(jié)果證實PINK1和TH存在一個共同體內(nèi)，兩者之間可能有相互作用。種種跡象表明PINK1可能是從慢速調(diào)節(jié)（TH表達(dá)量）和快速調(diào)節(jié)（TH的磷酸化修飾）雙方面來調(diào)節(jié)TH的活性。當(dāng)然，對于PINK1是否可以磷酸化TH，而改變TH的活性，最終影響DA的合成，目前仍不明確，將在今后的實驗進(jìn)行探討。通過本研究，可以豐富我們對于PINK1生理功能的認(rèn)識。此外，可能發(fā)現(xiàn)PINK1基因突變后導(dǎo)致PD發(fā)病的新線索，有助于理解PD發(fā)病，為臨床PD治療提供可能的藥物作用靶點，因此具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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The regulatory effects ofPINK1on dopamine biosynthesis

JIA Huan-zhen，LU Ling-ling，GONG Pu-sheng，F(xiàn)U Yue-jiao，ZHAO Chun-li，DUAN Chun-li，YANG Hui*
（Beijing Institute for Neuroscience，Beijing Center of Neural Degeneration and Repairing，Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

ObjectiveTo explore the role forPINK1in the regulation of dopamine biosynthesis.MethodsThe dopaminergic MN9D cells were used as a cell model for the present study.PINK1gene was knockdown by RNAi technique.The dopamine（DA）level，mRNA and protein expression level of tyrosine hydroxylase（TH）and dopa decarboxylase（DDC）were then detected by HPLC with electrochemical detection，real-time RT-PCR or Western blots 48h later，respectively.The association between PINK1 and TH was observed with Co-IP and immunohistochemistry.ResultsWhenPINK1was silenced，DA content was 5.356 ±0.536 μg/L significantly lower than the control group of 11.630±1.559 μg/L（P＜0.05），THmRNA and protein expression were 0.371±0.140 and 0.195±0.062 significantly lower than that of control group 1.009±0.152 and 0.386±0.044（P＜0.05），DDCmRNA and protein expression were 0.396±0.124 and 0.149 ±0.029 significantly lower than that of control group 1.009±0.152 and 0.386±0.044，respectively（P＜0.05）.ConclusionsPINK1has a regulatory effect on dopamine biosynthesis，through its influence on TH and DDC.

PINK1;RNA interference;tyrosine hydroxylase;MN9D cells

R 742.5

A

1001-6325（2012）01-0016-05

2011－07－28

2011－11－23

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2011CB504103）;國家自然科學(xué)基金（30970940）;北京市教育委員會科技發(fā)展計劃重點項目（KZ201010025022）;北京市自然基金面上項目（5102012，5102007）;北京市高校人才強(qiáng)教資助PHR（200907113）

*通信作者（corresponding author）:huiyang0105@sina.com