谷麗娟，侯建明，甄艷軍，李愛英

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部，河北石家莊 050091）

偏硅酸鈉抑制家兔外周血白細(xì)胞活性氧的生成

谷麗娟，侯建明*，甄艷軍，李愛英

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部，河北石家莊 050091）

*通信作者（corresponding author）:jckbsh@126.com

高血脂時(shí)外周血白細(xì)胞引爆和激活，產(chǎn)生過多活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制過量的ROS產(chǎn)生對(duì)于控制動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展具有重要意義［1］。以往研究發(fā)現(xiàn)偏硅酸鈉（Na2SiO3）有抗炎效應(yīng)［2］。本實(shí)驗(yàn)觀察Na2SiO3對(duì)家兔外周血白細(xì)胞ROS的抑制作用，為Na2SiO3抗AS機(jī)制提供進(jìn)一步資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物:清潔級(jí)新西蘭家兔（河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào):1004218），雄性，體質(zhì)量1 500～2 000 g。

1.2 制備ox-LDL:從健康家兔耳中動(dòng)脈取血，沉淀法提取低密度脂蛋白，置硫酸銅（CuSO4）溶液中37℃氧化24 h得氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。

1.3 分離白細(xì)胞:兔淋巴細(xì)胞分離液分離健康家兔血細(xì)胞，取出單個(gè)核細(xì)胞層和中性粒細(xì)胞層混合，得到白細(xì)胞懸液。

1.4 白細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定:采用DCFH-DA探針測(cè)定ROS。

1.5 體外ox-LDL刺激白細(xì)胞分組:分離的兔外周血白細(xì)胞分成6組。1）正常對(duì)照組;2）ox-LDL組:ox-LDL終濃度50 mg/L;3）68.5組、4）34.2組、5）17.1組和6）8.5組:培養(yǎng)液中加ox-LDL（50 mg/L）并Na2SiO3，硅的終濃度分別68.5、34.2、17.1和8.5 mg/L。以無血清DMEM懸浮細(xì)胞，總體積1 mL（含細(xì)胞3×106個(gè)），37℃搖動(dòng)孵育3 h，裝載 DCFH-DA探針，洗滌細(xì)胞2次后測(cè)熒光值（3 h熒光值）。然后恢復(fù)ox-LDL和 Na2SiO3濃度，繼續(xù)孵育30 min后再次測(cè)熒光值（3 h+30 min熒光值）。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組:12只家兔分為3組。1）正常組:普通飼料喂養(yǎng);2）高脂組:高脂飼料;3）Na2SiO3組:與高脂組同步飼喂高脂飼料3周，第4周按每日2 mg硅/kg的量給予Na2SiO3溶液100 mL為飲用水，仍然高脂飼料喂養(yǎng)。共計(jì)4周后分離外周血白細(xì)胞。每只家兔細(xì)胞分成3組:1）空白組，培養(yǎng)液中不加其他試劑;2）PMA組，培養(yǎng)液中加入終濃度100 μg/L氟波醇豆蔻酸鹽乙酸酯（phorbol-myris-tate-acetate，PMA）;3）PMA+Si組，加 PMA和 Na2SiO3，硅的終濃度8.5 mg/L。分離白細(xì)胞后60 min內(nèi)測(cè)定熒光值。

2 結(jié)果

2.1 Na2SiO3對(duì)體外ox-LDL刺激白細(xì)胞生成ROS的作用:加硅各組3 h熒光值和3 h+30 min熒光值均比ox-LDL組降低，其中8.5組（P＜0.01）（圖1）。

圖1 Na2SiO3對(duì)ox-LDL刺激的白細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響Fig 1 The effect of sodium metasilicate on ROS production of PBL stimulated with ox-LDL

2.2 Na2SiO3對(duì)高脂血癥家兔白細(xì)胞生成ROS的作用:動(dòng)物飼養(yǎng)4周后，正常組家兔血漿總膽固醇濃度2.8 mmol/L，高脂組為10.5 mmol/L，Na2SiO3組為10.8 mmol/L，與高脂組無差別。

以60 min內(nèi)最高熒光值，不同家兔組之間比較:3種處理白細(xì)胞方法均顯示，高脂組家兔白細(xì)胞ROS比正常組增加，Na2SiO3組比高脂組顯著下降（圖2A）。相同家兔白細(xì)胞不同處理組之間比較:正常組和高脂組家兔的PMA組ROS比空白組顯著增加，正常組和Na2SiO3組家兔的PMA+Si組比PMA組ROS顯著下降，Na2SiO3組家兔的PMA+Si組比空白組ROS顯著下降（圖2B）。

圖2 偏硅酸鈉抑制高膽固醇血癥家兔白細(xì)胞ROS的產(chǎn)生Fig 2 Administration of sodium metasilicate to hypercholesteremia rabbits inhibited ROS production of the PBL

3 討論

健康家兔白細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，3 h熒光值代表ox-LDL刺激3 h后白細(xì)胞內(nèi)ROS量，3 h+30 min熒光值代表在3 h后再次加入ox-LDL 30 min后的ROS量。文獻(xiàn)中觀測(cè)ROS的實(shí)驗(yàn)一般在較短時(shí)間測(cè)定ROS量（0.5～1 h），本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)3h以上，8.5組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光值均比ox-LDL組顯著降低，說明從長(zhǎng)時(shí)間累積效應(yīng)看，適當(dāng)濃度的Na2SiO3對(duì)ox-LDL刺激的白細(xì)胞ROS產(chǎn)生具有顯著抑制作用。

高血脂動(dòng)物的外周血白細(xì)胞處于引爆狀態(tài)，表現(xiàn)為PMA刺激后產(chǎn)生的ROS比正常細(xì)胞多。ox-LDL能直接激活白細(xì)胞，即沒有任何刺激物時(shí)高血脂動(dòng)物ROS也會(huì)比正常白細(xì)胞多。本實(shí)驗(yàn)高脂組家兔的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述相符。Na2SiO3組白細(xì)胞加或不加PMA所產(chǎn)生的ROS均比高脂組下降，而且體外再加Na2SiO3能進(jìn)一步抑制PMA對(duì)白細(xì)胞的刺激作用，表明Na2SiO3可以抑制高脂條件下白細(xì)胞引爆和激活。Na2SiO3組是在家兔形成高血脂后短期飲用Na2SiO3即檢測(cè)ROS，其血脂水平與高脂組無差異，而ROS比高脂組顯著下降，提示Na2SiO3抑制白細(xì)胞的引爆和激活不是通過降低血脂，這種獨(dú)立于降血脂的抗炎效應(yīng)對(duì)抑制AS發(fā)生發(fā)展有重要意義。

［1］Mazor R，Shurtz-Swirski R，F(xiàn)arah R，et al.Primed polymorphonuclear leukocytes constitute a possible link between inflammation and oxidative stress in hyperlipidemic patients［J］.Atherosclerosis，2008，197:937 －943.

［2］黃偉，李麗緯，甄艷軍，等.偏硅酸鈉對(duì)ECV-304細(xì)胞系與單個(gè)核細(xì)胞黏附的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29:796－798.

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1001-6325（2012）01-0094-02

2011－05－26

2011－11－24

河北省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（08276101D-103）