黃立寧，韓建民，劉 雅，劉 悅，曹翠麗

（河北醫(yī)科大學(xué)1.第二醫(yī)院麻醉科;2.神經(jīng)生物研究室，河北石家莊 050000）

新生大鼠海馬神經(jīng)元原代無血清培養(yǎng)與鑒定

黃立寧1，韓建民1，劉 雅1，劉 悅1，曹翠麗2*

（河北醫(yī)科大學(xué)1.第二醫(yī)院麻醉科;2.神經(jīng)生物研究室，河北石家莊 050000）

目的 建立一種簡單、易行的海馬神經(jīng)元無血清體外培養(yǎng)方法以獲得高純度、高活力的海馬神經(jīng)元。方法取新生24 h內(nèi)SD大鼠，分離海馬，經(jīng)消化后種植于包被有Matrigel基膜的玻片上，24 h后換含有N2、B27的Neurobasal無血清培養(yǎng)基，于不同時間在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài);采用β-tublinⅢ免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)鑒定海馬神經(jīng)元純度。結(jié)果 大部分海馬神經(jīng)元于3～24 h貼壁且可長出細長突起，3 d細胞具有典型神經(jīng)元的形態(tài)特征，5d后神經(jīng)元突起進一步增多并形成稠密的網(wǎng)絡(luò)連接，7 d后神經(jīng)元胞體豐滿，趨于成熟。經(jīng)β-tublinШ免疫熒光技術(shù)鑒定純度為94.2%±3.6%。結(jié)論 此方法簡單有效，可獲得高純度的海馬神經(jīng)元。

海馬;神經(jīng)元;原代培養(yǎng);新生大鼠

對于眾多神經(jīng)領(lǐng)域研究，諸如神經(jīng)元發(fā)育分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機制，原代培養(yǎng)的神經(jīng)元是一個很好的實驗?zāi)Ｐ?，具有影響因素單一、機體干擾因素少和結(jié)果易分析等優(yōu)點。所以，常用于細胞和分子水平上深入研究神經(jīng)元物質(zhì)代謝、生理、藥理及形態(tài)特征［1－2］。海馬屬于大腦的邊緣系統(tǒng)，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理變化等方面有重要作用，而且海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的神經(jīng)干細胞聚集區(qū)，具有高度序化板層結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元相對獨立分布的特點，境界相對清晰，便于取材，因此，海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型被廣大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究者當做理想的實驗?zāi)Ｐ?。但在原代培養(yǎng)中海馬神經(jīng)元的純度、活力及產(chǎn)量還存在一些急待解決的問題。本研究參考原有的培養(yǎng)方法并進行改進，獲得了一種簡單、易行的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)方法，為今后研究麻醉藥對海馬神經(jīng)元毒性作用提供高純度的海馬神經(jīng)元。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:新生24 h內(nèi)清潔級SD大鼠，體質(zhì)量4.8～6.5 g，雌雄不限，（河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號:1106088）。

1.1.2 主要試劑:DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）、B27、N2培養(yǎng)基添加劑（Gibco公司）;Neurobasal培養(yǎng)基（Invitrogen公司）;Accutase酶、Hoechst 33258（Sigma公司）;小鼠抗大鼠β-tublinШ單克隆抗體（Millipore公司）;FITC標記山羊抗鼠IgG（KPL公司）;Matrigel基膜（BD公司）;青鏈霉素（華北制藥集團）。

1.1.3 主要儀器:倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡TE2000-S（Nikon公司），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)板的預(yù)處理:24孔塑料培養(yǎng)板放入蓋玻片平鋪 Matrigel基膜（1∶30，DMEM 稀釋），放入培養(yǎng)箱，孵育1 h，接種細胞前吸出待用。

1.2.2 海馬神經(jīng)元的分離、純化和培養(yǎng):取新生24 h內(nèi)SD大鼠經(jīng)75%乙醇浸泡、消毒。剪開皮膚和顱骨，暴露兩側(cè)大腦半球，用彎鑷取出大腦并放入含預(yù)冷PBS液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于冰床上，用眼科無齒尖鑷小心分開皮層，暴露并取出雙側(cè)海馬組織，冷PBS液反復(fù)沖洗，去除殘留血管和腦膜后用眼科虹膜剪將海馬組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，將其移入離心管，以800 r/min 5 min離心棄上清，加入3倍于海馬組織體積的Accutase酶，放入培養(yǎng)箱消化10～20 min，其間震蕩數(shù)次，當消化液混濁、不含有明顯組織塊時，加入含10%FBS的DMEM液終止消化，經(jīng)充分吹打，200目銅濾網(wǎng)過濾。收集過濾后的細胞以800 r/min 5 min離心，棄上清，加入含10%FBS的DMEM液，吹打成細胞懸液。轉(zhuǎn)至塑料培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱經(jīng)差速貼壁1 h，收獲貼壁速度較膠質(zhì)細胞慢的神經(jīng)元，吹打后以0.4%臺盼藍染色計數(shù)活細胞并調(diào)整懸液的細胞密度，按1×106/mL的濃度將細胞種植在Matrigel基膜包被后的蓋玻片上，每片加150 μL細胞懸液，將接種好的24孔板置于含有去離子水的濕盒中，將其放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，24 h內(nèi)全量換含有1%N2、2%B27的Neurobasal培養(yǎng)液，其后，每2天半量換液，并在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長情況。

1.3 大鼠海馬神經(jīng)元的免疫熒光細胞化學(xué)鑒定

1.3.1 免疫熒光細胞化學(xué):取出蓋玻片，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.3%Triton X-100透膜15～20 min，10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）37℃孵育30 min封閉非特異性結(jié)合位點，傾去血清加入2%BSA稀釋的小鼠抗大鼠β-tublinШ單克隆抗體（1∶200）4℃過夜，加入2%BSA稀釋的1∶50 FITC標記的羊抗小鼠IgG二抗、50 mg/L Hoechst 33258復(fù)染細胞核，濕盒內(nèi)室溫避光孵育1 h，所有操作步驟前經(jīng)1×PBS輕洗3遍，每次5 min，濾紙吸干蓋玻片多余液體。倒置熒光顯微鏡下觀察，同一視野用不同的激發(fā)光激發(fā)FITC和Hoechst33258分別攝取細胞和細胞核的熒光圖片，利用顯微鏡自帶NIS成像軟件將所得圖片進行組合。

1.3.2 大鼠海馬神經(jīng)元純度的鑒定:以β-tublinШ單克隆抗體熒光染色顯示海馬神經(jīng)元，用 Hoechst33258復(fù)染顯示所有細胞核。神經(jīng)元純度計算方法:在高倍顯微鏡下隨機選取5個視野，計算出其中陽性細胞的個數(shù)，換算成百分比，重復(fù)5次，取其均值作為陽性神經(jīng)元的純度。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的形態(tài)觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的細胞呈圓形，體積小、透亮呈懸浮狀態(tài)，單個均勻分布，培養(yǎng)3 h后開始貼壁，細胞接種20 h后可見大部分細胞已貼壁，但培養(yǎng)液內(nèi)組織殘渣較多，換液去除殘渣。貼壁細胞形態(tài)多呈梭形、三角形，長出細長突起，長短不一。3 d后細胞具有典型神經(jīng)元的形態(tài)特征，胞體飽滿，多呈梭形，少數(shù)呈不規(guī)則形，胞漿豐富，突起較前明顯增長、增粗，連接成網(wǎng)絡(luò)，仍可見少量扁平狀的神經(jīng)膠質(zhì)細胞。5 d后神經(jīng)元胞體繼續(xù)增大，互相遷移靠近，開始形成集落樣神經(jīng)元群落，突起已形成較稠密的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)。7～10 d神經(jīng)元胞體最豐滿，周圍光暈明顯，突起交織成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)，突起增粗增長且光暈明顯，立體感增強。14 d后細胞聚集現(xiàn)象明顯，培養(yǎng)板上出現(xiàn)明顯的細胞間空白區(qū)域。20 d后神經(jīng)細胞開始退化，細胞邊緣光暈變淡，突起開始退縮，部分細胞核固縮明顯（圖1）。

2.2 海馬神經(jīng)元純度鑒定

經(jīng)β-tublinШ單克隆抗體和Hoechst33258在熒光倒置顯微鏡下鑒定（圖2），計算海馬神經(jīng)元純度為94.2%±3.6%。

3 討論

海馬是神經(jīng)元相對獨立分布并較為集中的組織，涉及學(xué)習(xí)、記憶及情緒反應(yīng)等許多復(fù)雜生理功能，因此，海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)在基礎(chǔ)和臨床研究應(yīng)用十分廣泛。但是，一直以來神經(jīng)元在原代培養(yǎng)中都是死亡率較高的一類細胞，在海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)過程中，如何提高神經(jīng)元的純度、貼壁率和活力一直困擾著廣大的研究者。

圖1 體外培養(yǎng)不同時間大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察Fig1 Hippocampal neurons derived from new-born rats cultured at different time（×200）

圖2 培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)細胞免疫熒光染色Fig 2 Immunofluorescence staining of hippocampal neurons on the 7th day

本實驗汲取過去部分研究者的經(jīng)驗［3－5］并結(jié)合自身體會就海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)過程中的經(jīng)驗，現(xiàn)總結(jié)如下:1）實驗從取材到接種完畢的時間一定控制在2h內(nèi)完成且取材過程在冰床上進行，以保持細胞的活力。2）在消化剪碎的組織時，存在較高濃度的胰蛋白酶對細胞表面損傷較大，消化時間不易掌握;而較低濃度的胰蛋白酶消化不徹底以致所得細胞數(shù)量少等問題，因此本實驗未使用傳統(tǒng)的胰蛋白酶而采用Accutase酶。Accutase酶具有膠原酶和蛋白酶活性，作用更溫和，消化時間要求相對寬松，對細胞表面損傷相對較小且消化較徹底，從而使細胞具有更高的活力。在人胚皮層神經(jīng)干細胞培養(yǎng)中應(yīng)用Accutase酶發(fā)現(xiàn)［6］比胰蛋白酶培養(yǎng)的同期細胞團直徑大，推測與Accutase酶作用溫和，對細胞特別是形成神經(jīng)球必需的細胞黏附分子的損傷相對較小有關(guān)。3）在包被玻片時，未使用多聚賴氨酸，而使用Matrigel基膜，Matrigel是從小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物，此種肉瘤不僅富含細胞外基質(zhì)蛋白，還含有TGF-β，F(xiàn)GF，tPA和其他生長因子。在室溫下，可聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，其作用與哺乳動物細胞基底膜類似，有研究者成功地將Matrigel基膜用于人胚胎干細胞的培養(yǎng)［7］，本研究嘗試性將Matrigel基膜取代傳統(tǒng)的多聚賴氨酸用于海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，取得了良好的效果。4）在抑制膠質(zhì)細胞過度增殖方面，本研究用差速貼壁和無血清培養(yǎng)相結(jié)合的方法，未使用阿糖胞苷，避免了因加入阿糖胞苷引起的神經(jīng)元損傷。5）接種前充分混勻，接種時依靠表面張力將接種液在玻片上接種呈半圓形，此種方法即可以減少接種液用量又可使細胞至玻片的距離縮短，提高貼壁率。

用此方法培養(yǎng)可獲得高純度、高活力的海馬神經(jīng)元，方法簡單無需特殊設(shè)備，在普通的細胞培養(yǎng)室即可完成。所培養(yǎng)的細胞能夠建立體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，形成有效的突觸連接，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Serum-free primary culture and identification of hippocampal neurons from newborn rats

HUANG Li-ning1，HAN Jian-min1，LIU Ya1，LIU Yue1，CAO Cui-li2*

（1.Dept.of Anaesthesiology，the Second Hospital;2.Dept.of Neurobiology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo establish a simple and practical method of the serum-free primary culture of hippocampal neuronsin vitroto obtain highly purified and energetic neurons.MethodsHippocampi of newborn rats after birth in 24 hours were taken out and digested.Hippocampal neurons were planted on the glass slides covered with Matrigel basement membrane.Twenty-four hours after the cell being plated，the culture medium was removed and replaced by serum-free neurobasal one with N2 and B27 supplementations.The morphological changes of the neurons were observed under inverted phase-contrast microscope at different time.Immunofluorescence staining for β-tublinⅢ was performed to identify the purity of neurons.ResultsA large number of hippocampal neurons began to adhere to the glass slides and develop small neurites in 3～24 hours.Then，cells with typical neuron morphology appeared on the third day.Up to the 5th day，many neurites extended to form dense network.Soma of neurons became well developed on the 7th day.Fluorescence staining with β-tublinⅢ showed that the purity of neurons was 94.2% ±3.6%.ConclusionsThe present protocol is a simple and efficient method for culturing hippocampal neurons with high purity.

hippocampus;neurons;primary culture;newborn rats

R-331

A

1001-6325（2012）01-0083-04

2011－05－20

2011－07－18

河北省2011年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃（20110338）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:caocuili615@163.com