劉 玉，王海軍，溫進坤，李愛英，李菁菁，韓 梅*

（河北醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點實驗室，河北石家莊 050017;2.中醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北石家莊 050091;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室，河北石家莊 050017;4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北保定 071000）

AngⅡ促進大鼠血管平滑肌細胞增殖和遷移

劉 玉1，2，王海軍4，溫進坤1，李愛英2，李菁菁3，韓 梅1*

（河北醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點實驗室，河北石家莊 050017;2.中醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北石家莊 050091;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室，河北石家莊 050017;4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北保定 071000）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖、遷移和細胞外基質(zhì)的合成是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要細胞病理學(xué)基礎(chǔ)［1］。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）的促生長作用參與了高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)生和發(fā)展。本實驗觀察AngⅡ?qū)SMCs細胞增殖及遷移的影響，進一步闡明血管增殖性疾病的發(fā)病機理，為臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與試劑:80～100 g健康雄性SD大鼠，取胸腹主動脈血管中膜用貼塊法分離、培養(yǎng)VSMCs［2］。取3～6代細胞進行實驗。待細胞生長至70%～80%匯合后換用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)16 h，使細胞處于靜止期，然后換用含2%FBS 的 培 養(yǎng) 液，分 別 加 入 不 同 濃 度 （10－8、10－7和10－6mol/L）的 AngⅡ（Sigma公司）孵育24 h，或10－7mol/L的AngⅡ孵育不同時間 （3、6、12、24和48 h），收集細胞用于實驗。

1.2 細胞增殖活力分析:利用細胞計數(shù)方法進行細胞增殖活性分析［3］。

1.3 傷口愈合實驗:將VSMCs接種于玻片上，于低倍鏡下觀察細胞傷口愈合情況。任意取3個視野，計數(shù)遷移細胞的數(shù)量，以此表示細胞的遷移活性。

1.4 總RNA提取及RT-PCR:按照Invitrogen公司的產(chǎn)品手冊，采用 Trizol一步法，從不同處理組的 VSMCs中提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度。按照Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。繼之，建立PCR反應(yīng)體系，置PCR儀上進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ?qū)SMCs增殖和遷移的影響:隨著AngⅡ濃度增加，VSMCs增殖和遷移不斷升高（圖1）。其中，AngⅡ濃度為10－7mol/L時細胞增殖和遷移明顯升高（圖1A，C），在此基礎(chǔ)上，選取10－7mol/L AngⅡ處理細胞，隨著刺激時間的延長，VSMCs增殖和遷移逐漸升高（圖1B，D）。具有明顯的量-效和時-效關(guān)系。

2.2 AngⅡ?qū)SMCsSM22α和PCNAmRNA表達的影響:隨著AngⅡ濃度增加，SM22α mRNA表達逐漸降低，在10－7mol/L時明顯降低（P＜0.01），隨著AngⅡ刺激時間延長，SM22α表達逐漸降低，在12 h時降低較為顯著（P＜0.01）（圖 2）。與SM22α的表達變化相反，PCNA表達在10－7mol/L時明顯增高（P＜0.01）（圖2A）。PCNA表達在24 h明顯升高（P＜0.01）（圖2B）。

3 討論

VSMCs的增殖和遷移是導(dǎo)致許多心血管疾病的重要的病理學(xué)基礎(chǔ)。生理條件下VSMCs存在著有序的增殖與凋亡，二者保持平衡。在許多病理情況下，外界環(huán)境造成某些生長因子增多，繼而通過刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，促進某些基因表達增多，從而使VSMCs的增殖失控，導(dǎo)致血管壁一系列的病理改變。因此，抑制VSMCs的增殖是有效治療動脈粥樣硬化、高血壓與血管再狹窄等心血管疾病的重要措施之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，以濃度和時間依賴的方式促進VSMCs增殖。傷口愈合實驗結(jié)果顯示，AngⅡ同樣以濃度和時間依賴的方式促進VSMCs的遷移活性，促進其向血管內(nèi)膜下遷移。

本研究采用RT-PCR方法，在轉(zhuǎn)錄水平證實，AngⅡ可抑制VSMCs分化標志基因SM22α的表達，同時促進增殖標志基因PCNA的表達，并且具有明顯的濃度和時間依賴效應(yīng)。

以上結(jié)果表明，AngⅡ可以通過影響VSMCs分化標志基因SM22α和增殖標志基因PCNA的表達而促進VSMCs增殖和遷移。本研究為揭示VSMCs增殖的發(fā)生機制，防治血管重塑和逆轉(zhuǎn)增殖性血管病變具有重要的意義。

［1］Li HX，Han M，Michel B，et al.Krüppel-like factor 4 promotes differentiation by transforming growth factor-β receptor-mediated smad and P38 MAPK signaling in vascular smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2010，285:17846－17856.

［2］Han M，Wen JK，Zheng B，et al.Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，291:C50－C58.

［3］Bishop-Bailey D，Hla T，Warner TD.Intimal smooth muscle cells as a target for peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand therapy［J］.Circ Res，2002，91:210－217.

R 3

A

1001-6325（2012）01-0089-03

2010－11－02

2011－05－30

國家自然科學(xué)基金（31071003）;國家自然科學(xué)基金（青年基金）（30700405）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:hanmei@hebmu.edu.cn

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