劉春蘭，杜 寧，徐桂云，黃 瀟，阿西娜

(1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.中國科學(xué)院化學(xué)研究所， 北京 100080)

鹿蹄橐吾多糖LW21的分離純化及其結(jié)構(gòu)分析

劉春蘭1，杜 寧1，徐桂云2，黃 瀟1，阿西娜1

(1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.中國科學(xué)院化學(xué)研究所， 北京 100080)

目的：確定鹿蹄橐吾多糖LW21的結(jié)構(gòu)，為探討鹿蹄橐吾多糖的藥理活性，合理利用鹿蹄橐吾這種植物資源提供依據(jù)。方法：水提取醇沉獲得鹿蹄橐吾水溶性粗多糖LW，經(jīng)酸性乙醇分級和DEAE-SephdexA-25純化得多糖LW21。紙層析、醋酸纖維薄膜電泳和Sepharose CL-4B柱層析進(jìn)行純度鑒定，LW21結(jié)構(gòu)分析采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析及IR、NMR、GC和GC-MS等方法。結(jié)果表明：LW21為均一多糖，相對分子質(zhì)量約為1.1×106。其單糖組成為鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)，物質(zhì)的量比為7.4:11.9:25.7:40.0:14.9。多糖LW21為有分枝結(jié)構(gòu)，主鏈由Glc和Man構(gòu)成，其中其中Man主要以β(1→2)和β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在3-O處和6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵在2-O和4-O處有分枝，Glc也主要以β(1→2)及β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵連接，在2-O處有分枝。分子支鏈由Ara、Rha、Gal構(gòu)成。末端殘基為Gal、Ara、Rha、Glc。結(jié)論：鹿蹄橐吾多糖LW21是一新結(jié)構(gòu)多糖，為首次從鹿蹄橐吾中分離得到。

鹿蹄橐吾；多糖；甲基化分析；結(jié)構(gòu)分析

橐吾屬 (Ligularia Cass.)為菊科(Compositae)千里光族，全屬約有130種。該屬藥用植物較多，許多種類的根及根莖作為藏藥、維藥和民間草藥使用，有很長的藥用歷史[1]。鹿蹄橐吾，別名滇紫菀，是菊科植物鹿蹄橐吾(Ligularia hodgsonii)的干燥全草，分布于我國四川東部、湖北、湖南等省。其根及根莖收入云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)，藥理研究表明醇溶物中具有祛痰鎮(zhèn)咳、殺菌消炎和抗腫瘤的活性[2-3]。鹿蹄橐吾的化學(xué)成分包括倍半萜類、生物堿、多羥基類小分子等[4]。劉春蘭等[5]對大黃橐吾水溶性多糖進(jìn)行了研究，證明其具有清除自由基的功能。目前國內(nèi)外對鹿蹄橐吾多糖結(jié)構(gòu)的研究還未見報道。多糖的多種生物活性與它的化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，活性多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)。因此本文選用鹿蹄橐吾為原料，對鹿蹄橐吾水溶性多糖提取、分離純化并測定其結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探討鹿蹄橐吾多糖的藥理活性，合理利用鹿蹄橐吾資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹿蹄橐吾(Ligularia hodgsonii)全草，采自四川阿壩，由中國科學(xué)院植物研究所陳藝林研究員鑒定。

NaBH4美國Sigma-Aldrich公司；DEAE-SephdexA-25、Sephrose CL-4B 瑞典Pharmacia公司；乙醇、乙醚、乙酸乙酯、醋酸、苯酚、高碘酸、碘甲烷、二甲基亞砜等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DB-5MS石英毛細(xì)管(30m×0.25mm，0.25μm) 美國GE公司；FC-95A餾分自助收集器 上海青浦滬西儀器廠；8002型電熱恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；LD4-8型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)；Qp2010A型氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀、Specord型紅外光譜儀日本島津公司；AVANCE400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 鹿蹄橐吾粗多糖LW的提取[6]

稱取5g干燥的鹿蹄橐吾，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇回流脫脂后，按料液比1:12(m/V)在85℃水浴提取3h，再加入4倍體積的95%乙醇沉淀，靜置過夜，3000r/min離心10min，回收上清乙醇，沉淀用無水乙醇、乙醚洗滌后真空干燥后得粗品鹿蹄橐吾多糖LW。

1.3.2 鹿蹄橐吾純化多糖LW21制備

將粗多糖LW配成2g/100mL溶液，采用鏈酶蛋白酶與Sevag法聯(lián)合脫蛋白[7-8]。用pH2.5的酸性乙醇分級得LW2。LW2經(jīng)DEAE-Sephdex A-25(2.5cm×90cm)柱層析，用0.5mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.75mL/min，每支試管接洗脫液2mL，苯酚-硫酸法顯色。根據(jù)苯酚-硫酸法檢測的結(jié)果合并收集相同峰位的組分，流水透析24h，去離子水透析24h，減壓濃縮至適當(dāng)體積，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，常規(guī)干燥制備得多糖LW21。

1.3.3 多糖LW21純度鑒定

1.3.3.1 紙層析法[9-10]

用新華1號中速濾紙(15cm×40cm)進(jìn)行層析，溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-醋酸-水(體積比為4:1:1)，苯胺-鄰苯二甲酸試劑顯色。

1.3.3.2 醋酸纖維薄膜電泳法

采用 0.025mol/L硼酸鹽為電極緩沖液(pH12.5)，電壓250V，電泳時間30min，用0.5%甲苯胺藍(lán)乙醇溶液染色。

1.3.3.3 柱層析法[10]

取5mg多糖配成10mg/L溶液，取0.5mL Sephrose CL-4B(1.5cm×90cm)柱層析上樣，0.1mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.45mL/min，每管收集2mL，根據(jù)苯酚-硫酸法測定多糖，繪制層析圖譜，觀察結(jié)果。

1.3.4 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的相對分子質(zhì)量測定

用0.5mL水溶解5mg標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖上樣，以Sepharose CL-4B(90cm×1.5cm)層析，0.1mol/L NaCl洗脫，流速為0.22mL/min，苯酚-硫酸法測多糖分布，用標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖已知相對分子質(zhì)量的(MW分別為1.0×107、5.0×106、2.0×106、7.0×105、1.0×104)相對分子質(zhì)量對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以洗脫體積(Ve)為橫坐標(biāo)，繪制lgMw-Ve標(biāo)準(zhǔn)曲線[11-12]。

同樣條件下測定LW21的洗脫體積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，求出相對分子質(zhì)量。

1.3.5 單糖組成分析

取2mol/L H2SO4完全水解后進(jìn)行紙層析[13]。

取1mg粗多糖，溶解于3mL三氟乙酸水溶液(2mol/L)中，120℃保溫1h，氮氣除去三氟乙酸水溶液。加入硼氫化鈉50mg氮氣流保護(hù)酸水解，加吡啶4mL，90℃水浴10min，加4mL乙酸酐90℃水浴20min，乙?；蠘樱筮M(jìn)行GC分析[14-15]。

GC條件：OV-210毛細(xì)管柱(30m×0.32mm，0.25μm)；柱溫100℃升高到250℃，程序升溫5℃/min；載氣為氫氣；流速為1.5mL/s；檢測器：FID。

1.3.6 LW21的結(jié)構(gòu)分析

1.3.6.1 紅外光譜(IR)分析與核磁共振譜分析

取1mg多糖LW21與10mg KBr研磨混合后壓片，紅外光譜儀在500～4000cm-1掃描[16]進(jìn)行IR分析。稱取10mg多糖LW21，溶于重水(D2O)，進(jìn)行核磁共振波譜分析[17]。

1.3.6.2 高碘酸氧化與Smith降解分析

準(zhǔn)確稱取50mg樣品按文獻(xiàn)[19-20]進(jìn)行高碘酸氧化、Smith降解，透析。透析后對袋內(nèi)外產(chǎn)物GC分析。GC條件同1.3.5節(jié)。

1.3.6.3 LW21的甲基化糖制備

取6mg LW21，用二甲基亞砜、固體氫氧化鈉粉、碘甲烷按文獻(xiàn)[17]進(jìn)行甲基化，IR檢測確證甲基化完全后，將甲基化產(chǎn)物用4mol/L三氟乙酸，100℃水解4h，氮氣吹干，經(jīng)乙?；瞥梢阴；苌颷21-23]，GC-MS定性和定量分析。

GC條件：柱室初始溫度120℃，以5℃/min升至250℃，保持10min，檢測器和進(jìn)樣器均為250℃。載氣為氦氣，線速41cm/s。

MS分析條件：EI源，離子源溫度250℃，離子化電勢70eV。

樣品用二氯甲烷溶解直接進(jìn)樣。根據(jù)色譜的各峰面積計算各種連接方式的物質(zhì)的量比，根據(jù)各峰的保留時間和質(zhì)譜碎片峰，確定其連接方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿蹄橐吾水溶性多糖的提取及分離純化

鹿蹄橐吾經(jīng)水提醇沉后得粗多糖LW，提取率為4.78%。LW為灰白粉末狀固體，溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。粗多糖經(jīng)分離純化得多糖LW21。LW21為淺棕色粉末狀，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑。

2.2 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的純度鑒定

LW21經(jīng)Sephrose CL-4B柱層析，苯酚-硫酸法檢測得單一對稱峰(圖1)，醋酸纖維薄膜電泳呈單一譜帶(圖2)，紙層析呈單一斑點。說明LW21為相對分子質(zhì)量及極性均一的純化多糖[18]。用凝膠洗脫法與標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖對照測LW21的相對分子質(zhì)量約為1.1×106。

圖1 多糖LW21的Sepharose CL-4B柱層析譜圖Fig.1 Chromatogram of LW21 on Sepharose CL-4B

圖2 多糖LW21的醋酸纖維薄膜電泳譜帶Fig.2 Cellulous acetate electrophoresis of LW21

2.3 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的組成分析

LW21經(jīng)紙層析和氣相色譜GC分析結(jié)果見圖3。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖(譜圖略)比較，結(jié)果表明，其單糖組成為：鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)，物質(zhì)的量比為7.4: 11.9: 25.7: 40.0: 14.9。LW21是由5種單糖殘基組成的雜多糖。

圖3 多糖LW21的GC譜圖Fig.3 GC chromatogram of LW21

2.4 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的IR、NMR分析

圖4 多糖LW21的紅外譜圖Fig.4 IR spectrum of LW21

由圖4可知，在3417、2941、1100cm-1附近處出現(xiàn)多糖的特征吸收峰，1000cm-1附近有3個吸收峰，說明LW21可能含有吡喃環(huán)和呋喃環(huán)。890cm-1處的吸收峰說明多糖LW21有β型糖苷鍵。810cm-1處的吸收峰說明多糖LW21也有α型糖苷鍵[10,15-16]。

圖5 LW21甲基化產(chǎn)物GC譜圖Fig.5 GC-MS of Chromatogram of LW21

多糖LW21以AVANCE400型核磁共振譜分析儀測定1H NMR，由圖5可知，在1H NMR譜中δ4.8～5.5范圍有5個C1上質(zhì)子的信號，化學(xué)位移δ值大于5.0的有1個，小于5.0的有5個，說明多糖LW21中存在α型和β型兩種[19]，與紅外分析結(jié)果相符。

2.4.2 高碘酸氧化和Smith降解

LW21進(jìn)行高碘酸氧化，經(jīng)紫外光譜在223nm檢測反應(yīng)完全后，測得每摩爾己糖消耗0.99mol IO4-，大于釋放甲酸量(0.40mol)的2倍，表明其除1→末端及1→6糖基外，尚有可被高碘酸氧化但不產(chǎn)生甲酸的1→2或1→4糖基，即可氧化糖基占70.30%，不可氧化糖基占29.70%[20]。

LW21經(jīng)Smith降解，對蒸餾水透析。袋內(nèi)、袋外產(chǎn)物進(jìn)行GC分析，結(jié)果如表1所示。

表1 Smith降解結(jié)果分析Table 1 Smith degradation analysis

由表1可知，袋內(nèi)上清和沉淀部分均檢出Gal和Man，袋外部分檢出赤蘚糖(Ery)和甘油(Gly)。根據(jù)高碘酸選擇性氧化的規(guī)則，說明多糖LW21中Gal和Man有不被高碘酸氧化的鍵型。袋外檢出赤蘚醇、甘油，說明多糖LW21中存在1→4、1→4,6、1→末端、1→2、1→6、1→2,6鍵型。

2.5 LW21的甲基化及其產(chǎn)物分析

為確定糖苷鍵的位置，對甲基化的多糖LW21經(jīng)水解、還原、乙?；蟮漠a(chǎn)物作氣相色譜-質(zhì)譜分析[21]，結(jié)果列于表2。

根據(jù)其衍生物的氣相色譜相對保留值和每個組分的質(zhì)譜圖可分析各組碎片峰，可確定甲基、乙酰基在衍生物分子上的位置，從而可確認(rèn)多糖中單糖組成和糖苷鍵連接位置[22]。

由表1中LW21甲基化產(chǎn)物GC-MS分析可知，LW21單糖組成為Rha、Ara、Man、Glc、Gal，與PC和GC分析結(jié)果一致。含有β(1→2)糖苷鍵的Man的物質(zhì)的量比為15.0，在多糖LW21中所占比例最大，構(gòu)成多糖LW21的主鏈之一，且在3位和6位上有分支，由物質(zhì)的量比可計算出平均每15個糖殘基有7個分枝。含有β(1→6)糖苷鍵的Man的物質(zhì)的量比為14.0，也構(gòu)成主鏈，且在2位和4位上有分枝，由物質(zhì)的量比可計算出平均每2個糖殘基有1個分枝。含有β(1→2)糖苷鍵的Glc的物質(zhì)的量比為12.0，在多糖LW21中所占比例較大，構(gòu)成多糖LW21的主鏈之一，且在6位上有分支，由物質(zhì)的量比可計算出平均每3個糖殘基有2個分枝。含有β(1→6)糖苷鍵的Glc的物質(zhì)的量比為7.0，也構(gòu)成多糖LW21的主鏈之一，且在2位上有分枝，由物質(zhì)的量比可計算出平均每11個糖殘基有4個分枝。支鏈由Ara、Rha、Gal構(gòu)成，其中Ara以1→2，1→4或1→5連接，Rha以1→2，1→5連接，Gal以1→6，1→2,3或1→4, 6連接，與高碘酸氧化Smith降解時在袋內(nèi)未檢出Rha、Ara、Man，袋內(nèi)檢出Gal的分析結(jié)果一致。Gal、Ara、Rha、Glc都有一部分構(gòu)成分子的末端殘基[23]。

表2 LW21甲基化產(chǎn)物的GC-MS分析Table 2 GC-MS analysis of methylated LW21

3 結(jié) 論

鹿蹄橐吾經(jīng)提取分離純化得均一多糖LW21，相對分子質(zhì)量約為1.1×106。經(jīng)高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析、IR分析、NMR波譜分析，結(jié)果均一致。證明LW21的基本結(jié)構(gòu)為Glc和Man構(gòu)成主鏈，其中Man主要以β(1→2)和β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在3-O處和6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵在2-O和4-O處有分枝；Glc也主要以β(1→2)及β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵連接在2-O處有分枝。分子支鏈由Ara、Rha、Gal構(gòu)成，其中Ara以1→2、1→4或1→5連接，Rha以1→2、1→5連接，Gal 以1→6、1→2, 3或1→4, 6連接。末端殘基為Gal、Ara、Rha、Glc。LW21是多分支結(jié)構(gòu)復(fù)雜的中性多糖。

鹿蹄橐吾多糖LW21為首次從四川天然鹿蹄橐吾中分離得到的均一多糖并測定其一級結(jié)構(gòu)。對于此多糖的構(gòu)效關(guān)系還有待于進(jìn)行后續(xù)工作。

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Isolation, Purification and Structural Analysis of Water-Soluble Polysaccharide LW21from Ligularia hodgsonii

LIU Chun-lan1，DU Ning1，XU Gui-yun2，HUANG Xiao1，A Xi-na1
(1. College of Life and Environmental Science, Minzu University of China, Beijing 100081, China；2. Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)

Objective: to isaolate, purify and structurally characterize a water-soluble polysaccharide from the whole herbs of Ligularia hodgsonii. Methods: crude polysaccharide named as LW was extracted from Ligularia hodgsonii. A ploysaccharide fraction named as LW21 was obtained after acidic ethanol fractionation and DEAE-Sephadex A-25 gel filtration. The purity of LW21 was identified by paper chromatography, Sepharose CL-4B chromatography and cellulous acetate electrophoresis, and its structure was analyzed by HIO4oxidation, Smith degradation, methylation, IR, NMR, GC and GC-MS. Results: LW21was a homogenous polysaccharide. LW21 was composed of rhamose (Rha), arabinose (Ara), mannose (Man), glucose (Glc) and galactose (Gal) with a molar ratio of 7.4: 11.9: 25.7: 40.0: 14.9. Its average molecular weight was 110 kD. Its main chain was made up of β-(1→2)-linked or β-(1→6)-linked Man, and β-(1→2)-linked orβ-(1→6)-linked Glc residues. The β-(1→2)-linked Man was substituted at 2-O and 4-O; β-(1→6)-linked Man was substituted at 3-O and 6-O; and β-(1→2)-linked Glc was substituted at 6-O; β-(1→6)-linked Gal was substituted at 2-O. The side chain was composed of Rha, Ara and Gal. The non-reduced end was composed of Gal, Ara, Rha and Glc. Conclusion: LW21 is a new polysaccharide isolated from Ligularia hodgsonii for the first time.

Ligularia hodgsonii；polysaccharide；methylation analysis；structural analysis

Q629

A

1002-6630(2012)11-0057-05

2011-05-27

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(0910KYZY44)；“111創(chuàng)新引智計劃”工程項目(B08044)；中央民族大學(xué)“985”工程項目(MUC985-9)

劉春蘭(1962—)，女，教授，碩士，研究方向為多糖化學(xué)。E-mail：liuchunlan888@yahoo.com.cn