劉 洋，郭宇星,*，潘道東,2

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

4種乳酸菌體外抗氧化能力的比較研究

劉 洋1，郭宇星1,*，潘道東1,2

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

通過抗脂質(zhì)過氧化、清除DPPH自由基、清除超氧陰離子自由基(O2-·)、還原力、清除羥自由基實驗對發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌4種乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的抗氧化能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明：4種乳酸菌的具有不同的抗氧化能力，其中瑞士乳桿菌的羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和還原能力相對較高，乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌清除O2-·能力相對較強(qiáng)，發(fā)酵乳桿菌抗脂質(zhì)過氧化能力為最強(qiáng)。實驗還初步研究乳酸菌的抗氧化機(jī)理，顯示乳酸菌存在SOD和GSH-Px，這可能與乳酸菌的抗氧化作用有一定相關(guān)性。

乳酸菌；發(fā)酵上清液；胞內(nèi)提取物；抗氧化能力

機(jī)體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生許多活性氧，如羥自由基、O2-·、過氧化氫等，當(dāng)體內(nèi)自由基含量過高時，其與生物大分子結(jié)合可造成機(jī)體損傷，可引發(fā)癌癥、關(guān)節(jié)炎、心血管等疾病[1-2]。通過補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，但許多化學(xué)合成的抗氧化物存在安全問題，因此找到天然抗氧化物成為解決此類問題最為有效的途徑。

乳酸菌具有抗癌、降膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、治療慢性尿道感染、延緩衰老等效應(yīng)[3]，其中許多是由于乳酸菌的抗氧化特性發(fā)揮作用。研究表明乳酸菌具有抗氧化活性[4]，王曦等[5]對35種乳酸菌的抗氧化能力進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)都具有不同程度的抗氧化能力。但目前的研究鮮有對具體的乳酸菌做系統(tǒng)的抗氧化比較研究。而且，現(xiàn)利用體內(nèi)和體外實驗中已證明乳酸菌具抗氧化活性，但對其作用機(jī)理的研究還不是很透徹。對乳酸菌抗氧化的機(jī)理主要有下列說法[6]：產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)；產(chǎn)生谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)；具有還原性；自身具有的NADH氧化酶和NADH過氧化酶活性；利用自身含有的阿魏酸酯酶(FAE)從食品基質(zhì)中生成阿魏酸(FA)等。

本實驗將對發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌4株乳酸菌的抗氧化能力做系統(tǒng)的比較研究，并對4株乳酸菌的SOD和GSH-Px的活性進(jìn)行檢測以及進(jìn)行還原力測定，初步分析抗氧化機(jī)理，旨在為新型天然抗氧化劑的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentium)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)為實驗室保藏菌株。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、檸檬酸氫二銨2g、葡萄糖20g，吐溫-80 1mL、乙酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g，蒸餾水1000mL，pH6.2～6.6，121℃滅菌15min。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、過氧化氫、FeSO4、FeCl3、鄰苯三酚、O-菲羅啉為國產(chǎn)分析純試劑 上海生工生物工程有限公司；SOD、GSH-Px檢測試劑盒 南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

722可見光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的培養(yǎng)及發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的制備

菌株以MRS培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)24h，傳3代后，10000r/min離心20min，收集上清液即為發(fā)酵上清液。菌體用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌后于10000r/min離心20min，以洗去培養(yǎng)基，重復(fù)3次。將菌體重懸于PBS緩沖液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞(每工作2S間歇1s，輸出功率300W)10min后，在4℃、10000r/min離心30min，收集上清液，即為胞內(nèi)提取物。將發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 清除羥自由基實驗[7-9]

試管中分別加入1mL 0.05mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液，0.5mL 6mmol/L的鄰二氮菲，充分混勻后，加入0.5mL 6mmol/L的FeSO4溶液，立即混勻。然后向其中加入0.5mL的樣品溶液，混勻，再加入0.5mL 0.1%的H2O2，最后補(bǔ)充體積到4mL，同時做損傷管和未損傷管，其中，損傷管中加入0.5mL 0.1%的H2O2，未損傷管不加H2O2，最后均將體積補(bǔ)充到4mL。于37℃保溫1h，測其在536nm波長處的吸光度。

式中：A為不加樣品時溶液的吸光度；A0為不加樣品和H2O2時溶液的吸光度；Ai為加樣品時溶液的吸光度。

1.3.3 清除DPPH自由基實驗[10-13]

將1mL待測液加1mL 0.006% 的DPPH乙醇溶液，室溫下靜置30min后，在517nm波長處測吸光度變化。

式中：Ai為1mL的DPPH溶液+1mL樣品的吸光度；Aj為1mL無水乙醇+1mL樣品的吸光度；A0為1mL DPPH溶液+1mL無水乙醇的吸光度。

1.3.4 清除O2-·實驗[14]

將0.1mL樣品加入4.5mL、pH8.0的Tris-HCl緩沖液，于25℃水浴預(yù)熱20min后，加入0.4mL 25mmol/L的鄰苯三酚，于25℃水浴反應(yīng)5min，立即用2滴8mol/L的HCl終止反應(yīng)，在325nm波長處測吸光度即為A，用蒸餾水調(diào)零?？瞻捉M用0.1mL H2O代替樣品即為A0。

1.3.5 還原力測定[15]

取0.5mL樣品加入濃度為0.2mol/L、pH6.6的磷酸緩沖溶液0.5mL及1%鐵氰化鉀0.5mL，于50℃水浴20min，急速冷卻。再加入10%三氯乙酸0.5mL，4000r/min離心10min，取上清液1mL，加入1mL蒸餾水及1mL 0.1%三氯化鐵，混合均勻。10min后，于700nm波長測定其吸光度。吸光度越大表示待測樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.6 抗脂質(zhì)過氧化能力測定[16-17]

脂質(zhì)體的制備：取一枚新鮮的卵黃與pH7.4、0.1mol/L PBS制成體積分?jǐn)?shù)10%的懸浮液，冰浴下高速乳化剪切10min后，于冰浴下超聲波處理20min，4℃密封保存。使用前磁力攪拌5min。

取0.5mL脂質(zhì)體、0.1mL樣品、0.4mL H2O與0.05mL 70mmol/L硫酸亞鐵混勻，在37℃條件下水浴30min后，加入0.5mL 10%的TCA和1mL 1%的TBA，沸水浴10min，4000r/min離心15min，取上清532nm波長處測定吸光度即為A。對照管中H2O代替樣品即為A0。

1.3.7 SOD和GSH-Px活性測定

采用試劑盒，按照說明操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除羥自由基實驗結(jié)果

表1 乳酸菌對羥自由基的清除率Table 1 Hydroxyl radical scavenging activity of lactic acid bacteria

由表1可知，4種乳酸菌均呈現(xiàn)一定的羥自由基清除能力，瑞士乳桿菌發(fā)酵上清液的羥自由基清除能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)；嗜酸乳桿菌胞內(nèi)提取物的羥自由基清除能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)。胞內(nèi)提取物的羥自由基清除能力相對發(fā)酵上清液而言要弱很多。由此可見，乳酸菌清除羥自由基的活性物質(zhì)主要存在菌體表面以及代謝產(chǎn)物中而非胞內(nèi)。不同乳酸菌的羥自由基清除能力存在一定差異，其中瑞士乳桿菌較其他3種乳酸菌要強(qiáng)一些，其余3種基本相似。其原因可能是不同乳酸菌清除羥自由基的活性物質(zhì)不同或活性物質(zhì)含量不同。

2.2 清除DPPH自由基實驗結(jié)果

表2 乳酸菌對DPPH自由基的清除率Table 2 DPPH free radical scavenging activity of lactic acid bacteria

由表2可知，4種乳酸菌的發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力，但其清除能力差異較大。瑞士乳桿菌發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)；乳酸乳球菌胞內(nèi)提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)。其中乳酸乳球菌發(fā)酵上清液的清除能力明顯低于其他菌株，而其胞內(nèi)提取物的清除能力明顯高于其他菌株，由此顯示不同菌株清除DPPH自由基的活性物質(zhì)的存在部位不同。瑞士瑞桿菌發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，胞內(nèi)提取物的DPPH自由基清除能力僅次于乳酸乳球菌，因此其DPPH自由基清除能力相對最高。

2.3 清除O2-·實驗結(jié)果

表3 乳酸菌對O2-·的清除率Table 3 Superoxide anion scavenging activity of lactic acid bacteria

由表3可知，4種乳酸菌的發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均呈現(xiàn)一定的O2-·清除能力，發(fā)酵上清液中的乳酸乳球菌O2-·清除能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)；胞內(nèi)提取物中的嗜酸乳桿菌的O2-·清除能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)。另外，胞內(nèi)提取物的O2-·清除能力都要比各自發(fā)酵上清液的的O2-·清除能力要強(qiáng)。實驗表明乳酸菌清除O2-·的活性物質(zhì)大部分存在于胞內(nèi)。由實驗可以得出乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌的O2-·清除能力強(qiáng)于發(fā)酵乳桿菌和瑞士乳桿菌。

2.4 還原力測定結(jié)果

表4 乳酸菌還原能力Table 4 Reducing powder of lactic acid bacteria

由表4可知，4種乳酸菌發(fā)酵上清液均表現(xiàn)一定的還原能力，瑞士乳桿菌的還原能力最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌的還原能力差異顯著(P＜0.05)；胞內(nèi)提取物未檢測到任何還原能力。瑞士乳桿菌的還原能力最強(qiáng)。實驗表明，乳酸菌具有還原能力的活性物質(zhì)均存在于細(xì)胞表面或代謝產(chǎn)物中，胞內(nèi)提取物未檢測到還原能力。

2.5 抗脂質(zhì)過氧化能力測定結(jié)果

表5 乳酸菌對抗脂質(zhì)過氧化的抑制率Table 5 Inhibitory rate of lactic acid bacteria on lipoperoxidation

由表5可知，4種乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均表現(xiàn)一定的抗脂質(zhì)過氧化能力，其中發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物抗脂質(zhì)過氧化能力均為最高，且與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)。發(fā)酵乳桿菌和瑞士乳桿菌發(fā)酵上清液的抗脂質(zhì)過氧化能力較胞內(nèi)提取物明顯高，乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液與胞內(nèi)提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力則基本一樣。實驗結(jié)果表明起抗脂質(zhì)過氧化的活性物質(zhì)在不同乳酸菌株中的含量分布不同。此4種乳酸菌中發(fā)酵乳桿菌的抗脂質(zhì)過氧化能力最強(qiáng)。

2.6 SOD活性測定結(jié)果

表6 乳酸菌SOD活性Table 6 SOD activity of lactic acid bacteria

測定中每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。由表6可知，4種乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均表現(xiàn)一定的SOD活性，發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的SOD活性明顯低于其他。嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液的SOD活性最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)；瑞士乳桿菌胞內(nèi)提取物的SOD活性最強(qiáng)，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)。另外，發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的SOD活性因不同菌株差異不是很顯著，表明乳酸菌的SOD在胞內(nèi)和胞外均有分布。SOD具有清除O2-·的能力，但研究表明SOD活性并未與O2-·清除率成正比，表明清除O2-·的活性物質(zhì)不止SOD，還有其他活性物質(zhì)影響O2-·的存在，如NADH氧化酶、過氧化酶等[18]。

2.7 GSH-Px活性測定結(jié)果

表7 乳酸菌GSH-Px活性Table 7 GSH-Px activity of lactic acid bacteria

規(guī)定每0.1mL發(fā)酵上清液或胞內(nèi)提取物在37℃反應(yīng)5min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個酶活力單位。由表7可知，4種乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均表現(xiàn)一定的GSH-Px活性。瑞士乳桿菌發(fā)酵上清液GSH-Px活性最高，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)；乳酸乳球菌胞內(nèi)提取物GSH-Px活性最高，與其余3種乳酸菌差異顯著(P＜0.05)。發(fā)酵上清液GSH-Px活性均高于胞內(nèi)提取物GSH-Px活性，表明代謝產(chǎn)物中GSH-Px的含量要多于胞內(nèi)。此外，GSH-Px也具有一定的清除O2-·的能力[19]，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌的GSH-Px活性最差，其清除O2-·的能力也最差，表明GSH-Px的存在對O2-·有一定的清除作用。但一種自由基在機(jī)體存在的多少不僅僅是一種抗氧化物質(zhì)在起作用，而是多種物質(zhì)的綜合作用，因此不能就此確定O2-·的含量少僅是由于GSH-Px的活性高所致，只能說明GSH-Px對O2-·有一定的抑制作用。

通過本實驗初步探討了乳酸菌的抗氧化機(jī)理：乳酸菌可以增強(qiáng)抗氧化酶(如SOD和GSH-Px)的活性，從而增強(qiáng)清除自由基的能力；發(fā)酵上清液具有還原性等。但目前還有研究表明，乳酸菌胞外多糖具有顯著的抗氧化能力[20]，乳酸菌的蛋白酶在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生具抗氧化能力的乳蛋白肽[21]。由此可見，乳酸菌的抗氧化機(jī)制是多種抗氧化物質(zhì)的綜合作用。

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌都具有抗氧化活性，但差異較大，其中瑞士乳桿菌的羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和還原能力相對較高，乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌清除O2-·能力相對較強(qiáng)，發(fā)酵乳桿菌抗脂質(zhì)過氧化能力為最強(qiáng)。此研究為乳酸菌抗氧化劑的進(jìn)一步研究提供了一定的參考。

通過研究還發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差異，可能是起抗氧化作用的活性物質(zhì)種類或濃度不同；并且，同一株乳酸菌的發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的抗氧化能力也存在較大差異，表明其抗氧化的活性物質(zhì)存在的部位不同。

本實驗檢測了發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌中SOD和GSH-Px兩種起抗氧化作用的酶，對于是否還有其他類活性物質(zhì)起作用以及各自在抗氧化過程中起何種作用有待進(jìn)一步研究。

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Comparative Antioxidant Activity of Four Species of Lactic Acid Bacteria in vitro

LIU Yang1，GUO Yu-xing1,*，PAN Dao-dong1,2
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China )

In this study, the antioxidant activity of the fermentation supernatants and intracellular extracts of four species of lactic acid bacteria including Lactobacillus fermentium, Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus helveticus was comparatively studied by anti-lipid peroxidation assay, reducing power assay, and DPPH and superoxide anion and hydroxyl free radical scavenging assays. The results indicated that different lactic acid bacteria had different antioxidant activity. Lactobacillus helveticus had higher hydroxyl radical scavenging activity, DPPH radical scavenging activity and reducing power, while Lactococcus lactis and Lactobacillus acidophilus had notable superoxide anion radical scavenging activity. In addition, Lactobacillus fermentium had the highest lipid peroxidation-inhibitory activity. Further, the antioxidant mechanism of lactic acid bacteria may be related to the presence of SOD and GSH-Px activities.

lactic acid bacteria；fermentation supernatant；intracellular extract；antioxidant activity

TS252

A

1002-6630(2012)11-0025-05

2011-08-30

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(水畜)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-43-17)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2009366)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31101314)；江蘇省教育廳高校自然科學(xué)基金項目(10KJB550003)；南京師范大學(xué)特聘教授、高層次人才科研啟動基金項目(184070H2B08)

劉洋(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為乳品科學(xué)。E-mail：291246635@qq.com

*通信作者：郭宇星(1981—)，女，講師，博士，研究方向為乳品科學(xué)。E-mail：yuxingguo1981@yahoo.com.cn