笪久香，李瑩瑩，欒廣忠,2,*，崔亞麗，胡亞云，李志成,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

無機鹽對木瓜蛋白酶凝固大豆分離蛋白凝膠的影響

笪久香1，李瑩瑩1，欒廣忠1,2,*，崔亞麗1，胡亞云1，李志成1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

為研究食品中常見無機鹽對木瓜蛋白酶凝固大豆分離蛋白凝膠的影響，以大豆分離蛋白(SPI)為原料，測定添加NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2和MgSO4等常見無機鹽后木瓜蛋白酶凝固SPI的時間、凝膠質(zhì)構(gòu)、凝固過程中pH值及蛋白質(zhì)降解程度的變化。結(jié)果表明：添加一定濃度的無機鹽可以縮短凝固時間并提高凝膠強度。相同離子強度下，Ca2+和Mg2+對凝固時間及凝膠強度影響均大于Na+和K+。添加無機鹽可使SPI的pH值降低，加酶后pH值再次持續(xù)下降，但一定時間后趨于穩(wěn)定。無機鹽的種類和濃度對木瓜蛋白酶凝固SPI過程中蛋白質(zhì)降解程度影響不明顯。SPI中CaCl2的離子強度為15(CaCl2濃度為5mmol/L)時，將酶添加量從0.15%減少到0.1%，可使凝膠強度提高60%。因此，添加適量的一價及二價無機鹽可顯著縮短酶凝固時間并提高凝膠強度。添加Ca2+和Mg2+等二價陽離子鹽類是提高木瓜蛋白酶凝固大豆蛋白凝膠強度的有效途徑。

無機鹽；木瓜蛋白酶；大豆分離蛋白；凝膠

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是將豆粉除去油脂和水溶性非蛋白成分后，得到的一種蛋白質(zhì)含量(N×6.25)不低于90%的混合物[1]。SPI的蛋白質(zhì)消化率修正氨基酸評分(PDCAAS)達到0.99[2]，是完全蛋白質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值。SPI具有溶解性、乳化性、起泡性和膠凝性等特性[3]，其中膠凝性是大豆蛋白重要的功能特性之一。目前制備大豆蛋白凝膠的方法主要有：加熱處理[4]、無機鹽和葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)處理[5]、高壓處理[6]、酶凝固法[7-8]等。酶法凝固大豆蛋白條件溫和、凝固物細膩，不但保持了其營養(yǎng)價值，還可以改善其功能特性[9]。但與酸類凝固劑和鹽類凝固劑相比，酶凝固法凝膠強度低，限制了其進一步應(yīng)用[10]。目前發(fā)現(xiàn)能夠凝固大豆蛋白的酶均為蛋白酶，如微生物蛋白酶、植物蛋白酶等[11]。其中，木瓜蛋白酶來源于植物，凝固活性較高[11]，在食品和醫(yī)藥中應(yīng)用也很廣泛[12]。

無機鹽對球蛋白的膠凝性具有很大的影響，如Ca2+、Mg2+通過靜電屏蔽及鹽橋作用可增強大豆蛋白的凝膠強度[5,13]。本實驗以SPI為原料，以木瓜蛋白酶為凝固劑，研究常見無機鹽NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2和MgSO4對木瓜蛋白酶凝固SPI的凝固時間、質(zhì)構(gòu)、pH值和蛋白質(zhì)降解等特性的影響，進而尋找可能提高酶法凝固大豆蛋白凝膠強度的有效方法，為其進一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI(素寶-760 IP，蛋白質(zhì)含量90%(干基)) 上海舒萊公司。

木瓜蛋白酶(木瓜乳凍干而得，EC3.4.22.2，酶活力3500U/mg) 美國Sigma公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂(均為分析純) 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S6型水浴鍋 北京科偉有限公司；TA.XT2質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；PHSJ-4A pH計 上海精科有限公司；Mini PROTEIN 3 Cell垂直板電泳設(shè)備美國Bio-Rad公司；Universal Hood Ⅱ全自動凝膠成像體系 意大利Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI分散液的制備

將SPI粉末分散于去離子水中，質(zhì)量濃度為4g/100mL，攪拌5min，經(jīng)沸水浴熱處理15min后，立即在冰水混合物中冷卻至4℃，備用。

1.3.2 木瓜蛋白酶凝固SPI凝固時間的測定

參照Arima等[14]的方法，取5mL預(yù)處理的SPI溶液于25mL試管中，加入一定量的無機鹽溶液，在40℃水浴保溫30min，加入體積分?jǐn)?shù)0.15%的5g/100mL酶液并開始計時(精確到秒)，迅速渦旋混勻后繼續(xù)保溫，觀察SPI的狀態(tài)，管壁開始出現(xiàn)凝固顆粒時，即判斷SPI凝固，所用的時間為凝固時間。以未添加無機鹽的SPI溶液為對照。

1.3.3 離子強度的計算

按照下式[15]計算離子強度(ionic strength，IS)。

式中：c為溶液中各離子的濃度/(mmol/L)；k為該離子的價數(shù)。

實驗中，SPI中NaCl、KCl離子強度與物質(zhì)的量濃度數(shù)值相同；CaCl2、MgCl2離子強度分別為6、15、30、40所對應(yīng)的分別為2、5、10、40/3mmol/L；MgSO4離子強度分別為6、15、30、40所對應(yīng)的物質(zhì)的分別為1.5、3.75、7.5、10mmol/L。無機鹽配制成2.0mol/L的溶液，計算添加至SPI溶液中所需的無機鹽的體積。

1.3.4 凝膠質(zhì)構(gòu)的測定

取50mL預(yù)處理的SPI溶液置于100mL燒杯中，之后操作按1.3.2節(jié)，凝固后30min取出置于冰水浴中冷卻至4℃，并于該溫度下保存過夜。

測定前30min取出SPI凝膠恢復(fù)至室溫，參照質(zhì)構(gòu)儀自帶的反向擠壓(back extrusion)程序進行測定。所得質(zhì)構(gòu)曲線中，χ軸上方曲線的最大峰所對應(yīng)的力表示硬度F/g ，代表凝膠的強度；χ軸下方的曲線最大峰所對應(yīng)的力與χ軸形成的面積表示凝膠的黏性指數(shù)(index of viscosity，IV)/(g·s)，代表凝膠的黏附性。

測定參數(shù)為：探頭：A/BE(直徑35mm)；測試深度：20mm；觸發(fā)應(yīng)力：0.5g；測試前速率：1mm/s；測試速率：1mm/s；測試后速率：10mm/s。

1.3.5 木瓜蛋白酶凝固SPI過程中pH值變化的測定

取50mL預(yù)處理后的SPI溶液，40℃水浴保溫30min，添加不同離子強度的無機鹽后，繼續(xù)保溫30min，測定SPI在添加不同離子強度無機鹽前后的pH值變化。再加入體積分?jǐn)?shù)0.15%的5g/100mL木瓜蛋白酶液，每隔一定時間測定pH值。

1.3.6 SDS-PAGE

參照Laemmli[16]的方法，于不同離子強度的酶凝膠中分別在凝固之前、凝固中、凝固后取樣，迅速的將樣品置于沸水浴中20min，使酶失活。采用不連續(xù)SDSPAGE：4.5%濃縮膠、10%分離膠，加樣量10μL，考馬斯亮藍R-250染色。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 無機鹽對木瓜蛋白酶凝固SPI凝固時間的影響

圖1 不同離子強度的無機鹽對木瓜蛋白酶凝固大豆蛋白凝固時間的影響Fig.1 Effect of salt ion strength on coagulation time of SPI gel

由圖1可知，隨著離子強度的增加，一價及二價鹽離子均使凝固時間縮短。其中CaCl2影響最大，當(dāng)離子強度為30時凝固時間為2.5min，而對照SPI(即離子強度為0時)為93min。MgCl2、MgSO4對凝固時間的影響與CaCl2相似，相同離子強度下三者對凝固時間的影響無顯著差異(P＞0.05)。NaCl離子強度為40時，凝固時間縮短為5min。KCl對凝固時間的影響與NaCl相似，二者差異也不顯著(P＞0.05)。在相同離子強度下，Na+和K+對凝固時間的影響極顯著小于Ca2+和Mg2+(P＜0.01)，其原因可能是一價鹽離子有靜電屏蔽作用[5]，二價鹽離子除此作用外，還會與大豆蛋白質(zhì)間形成“鹽橋”[17]。

2.2 無機鹽對木瓜蛋白酶凝固SPI凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

由表1可知，對于一價鹽離子，NaCl離子強度在0～15范圍內(nèi)，凝膠的F變化不大，IV先降低后增加；當(dāng)離子強度增加至30時，凝膠的F和IV均顯著增加(P＜0.05)；當(dāng)離子強度進一步增加至40時，凝膠的F有所降低，IV有所增加，但差異均不顯著(P＞0.05)。KCl對凝膠的F和IV的影響與NaCl相似。對于二價鹽離子，CaCl2、MgCl2離子強度分別在0～30、0～15范圍內(nèi)，凝膠的F和IV隨離子強度的增加而增加，相對于對照SPI均差異顯著(P＜0.05)；MgCl2的離子強度增加至30時，凝膠的F和IV均顯著下降(P＜0.05)；二者的離子強度繼續(xù)增加至40時，SPI形成顆粒狀沉淀，乳清大量析出。MgSO4離子強度從0增加至30，凝膠的F和IV均顯著增加(P＜0.05)；當(dāng)離子強度進一步增加至40時，凝膠的F和IV反而顯著降低(P＜0.05)。相比于對照，Ca2+對凝膠F和IV最大，其次是Mg2+、Na+和K+影響較小。

一價離子本身不能凝固大豆蛋白，離子強度增加時，可能通過靜電屏蔽作用使蛋白質(zhì)之間的斥力減弱[5]，從而提高了凝膠的F和IV。當(dāng)離子強度進一步增加時，無機鹽的電荷使蛋白質(zhì)的電荷完全屏蔽后，凝膠的F和IV均趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)為差異不顯著。

一定離子強度范圍內(nèi)，二價離子除了靜電屏蔽作用外，還會與蛋白質(zhì)的極性基團作用形成鈣橋[17]，從而提高了凝膠的F和IV；當(dāng)離子強度過大時，過多的二價陽離子會占據(jù)凝膠的陰離子位點，從而阻止了相鄰多肽鏈間的共價交聯(lián)，削弱了凝膠結(jié)構(gòu)[18-19]，因此凝膠F和IV均降低。

表1 不同離子強度的無機鹽對凝膠硬度和黏性指數(shù)的影響Table 1 Effect of salt ion strength on firmness and viscosity index of SPI gel

表2 不同無機鹽對酶凝固SPI過程中pH值變化的影響Table 2 Effect of salt ion strength on pH of SPI gel

2.3 無機鹽對木瓜蛋白酶凝固SPI過程中pH值變化的影響

由表2可知，添加一定量的無機鹽均使SPI溶液的pH值有不同程度的降低。對照組的pH值為7.02，加入NaCl或KCl后pH值降到6.90左右，加入CaCl2后pH值降到6.54，而加入MgCl2或MgSO4后pH值降到6.70左右。其原因可能是無機鹽離子與肽鏈氨基酸末端羥基競爭，使SPI溶液釋放了更多的H+，二價陽離子與肽鏈末端羧基的結(jié)合較一價陽離子更加緊密[20]，釋放的H+多，因此其降低pH值的程度比一價無機鹽大，這也可能是二價鹽離子縮短凝固時間比一價鹽離子程度大的原因。

蛋白質(zhì)酶解過程會造成pH值下降，降解程度與pH值降低程度正相關(guān)[21-22]。加酶凝固后，凝膠的pH值在一定時間后(如加酶150～180min后)趨于穩(wěn)定，說明蛋白質(zhì)的降解程度趨于穩(wěn)定。其他離子強度的無機鹽變化趨勢與其相似，數(shù)據(jù)未列出。

綜上所述，凝固過程中pH值的降低是無機鹽及肽鏈水解的綜合作用結(jié)果，這對凝固時間的縮短及凝膠強度的提高都是有利的。

2.4 無機鹽對木瓜蛋白酶凝固SPI過程中蛋白質(zhì)降解的影響

圖2 無機鹽對木瓜蛋白酶凝固SPI過程中蛋白質(zhì)降解情況的影響Fig.2 Effect of salt ion strength on protein degradation of SPI gel

由圖2可知，從電泳的條帶可以看出，無論是否添加無機鹽，加入木瓜蛋白酶后，SPI均迅速降解，而且降解程度非常相近。說明在實驗條件下，添加無機鹽對SPI的降解沒有明顯影響。其他離子強度的無機鹽對木瓜蛋白酶凝固SPI過程中蛋白質(zhì)的降解情況相似，數(shù)據(jù)未列于實驗中。

2.5 木瓜蛋白酶的添加量對凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

如2.2節(jié)所述，CaCl2對凝膠的F和IV影響最大，以CaCl2離子強度等于15為例，不同加酶量對凝固時間、F和IV的影響見表3。其他離子強度的無機鹽，不同加酶量對凝膠影響與其相似，數(shù)據(jù)未列出。

表3 木瓜蛋白酶的添加量對酶凝膠硬度和黏性指數(shù)的影響Table 3 Effect of papain amount on firmness and viscosity index of SPI gel

由表3可知，木瓜蛋白酶的添加量為0.025%時，由于酶用量過低，不能使SPI凝固形成凝膠。木瓜蛋白酶添加量為0.05%和0.1%時，凝固時間分別為57min和15.5min，凝膠強度較高；當(dāng)加酶量為0.15%和0.2%時凝固時間很短，為7.8min和5.1min，F(xiàn)相對于低添加量時顯著降低(P＜0.05)，同時對IV沒有顯著差異(P＞0.05)。因此通過添加CaCl2和調(diào)整木瓜蛋白酶的添加量可以提高凝膠強度，與對照組SPI凝膠23.3g(表1)相比，提高了約60%。

原因可能是：1)加酶量影響凝固時間，凝固速率影響凝膠的強度，凝固速率越快，凝膠的結(jié)構(gòu)越粗糙，凝膠強度越低[5,23]；2)加酶量影響蛋白的降解情況，加酶量越多，大豆蛋白的肽鏈被降解成小分子的速率越快，顯然，這對凝膠強度的提高是不利的。

圖3 木瓜蛋白酶添加量對SPI凝固過程中蛋白質(zhì)降解情況的影響Fig.3 Effect of papain amount on protein degradation of SPI gel

由圖3可知，低酶活性(添加量為0.05%，泳道3和4)時，木瓜蛋白酶對11S球蛋白的降解速度較慢，溶液中存在濃度較高的11S。有研究[24-25]表明，11S比例高的SPI凝膠的強度明顯高于11S比例低的凝膠。這也可能是低酶活性下凝膠強度較高的原因之一。

3 結(jié) 論

添加適量的無機鹽可以縮短木瓜蛋白酶凝固SPI的時間，提高凝膠強度。同一離子強度下，相對于一價鹽離子而言，二價鹽離子能更有效地縮短木瓜蛋白酶凝固SPI的時間，提高凝膠強度。通過添加無機鹽和調(diào)整木瓜蛋白酶的用量可以顯著提高木瓜蛋白酶凝固SPI的凝膠強度。

[1]KINSELLA J E. Functional properties of soy proteins[J]. Journal of the American Oil Chemistry Society, 1979, 56(3): 242-258.

[2]劉志皋. 食品營養(yǎng)學(xué)[M]. 2版. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2005: 42.

[3]KINSELLA J E. Functional properties of proteins in foods: a survey[J]. Critical Review in Food Science and Nutrition, 1976, 7(3): 219-280.

[4]SAIO K, WATANABE T, KAJI M. Food use of soybean 7S and 11S proteins extraction and functional properties of their fraction[J]. Food Science Technology, 1973, 38(7): 1139-1144.

[5]劉志勝. 豆腐凝膠的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001.

[6]SPERONI F, BEAUMAL V, LAMBALLERIE M, et al. Gelation of soybean proteins induced by sequential high-pressure and thermal treatments[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(5): 1433-1442.

[7]欒廣忠. 堿性蛋白酶Alcalase凝固豆?jié){機理的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[8]鐘芳, 王璋, 許時嬰. 凝固劑種類對大豆蛋白質(zhì)組分7S和11S膠凝能力的影響[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2003, 22(3): 12-17.

[9]LAMSAL B P, JUNG S, JOHNSON L A. Rheological properties of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis[J]. Food Science and Technology, 2007, 40(7): 1215-1223.

[10]欒廣忠, 程永強, 魯戰(zhàn)會, 等. 豆乳凝固酶的研究進展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2006, 79(10): 41-43.

[11]鐘芳, 王璋, 許時嬰. 大豆蛋白質(zhì)的酶促速凝[J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報, 2002, 21(6): 559-563; 573.

[12]熊華. 木瓜蛋白酶的應(yīng)用研究進展[J]. 四川食品與發(fā)酵, 2005, 41(4): 9-11.

[13]NAGANO T, TOKITA M. Viscoelastic properties and microstructures of 11S globulin and soybean protein isolate gels: magnesium chlorideinduced gels[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(7): 1647-1654.

[14]ARIMA K, YU Y, IWASAKI S. Milk-clotting enzyme from microorganisms[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1967, 31 (5): 540-542.

[15]徐春霞. 無機及分析化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010: 267.

[16]LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685.

[17]PUPPO M C, AN~ON M C. Structural properties of heat-induced soy protein gels as affected by ionic strength and pH[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(9): 3583-3589.

[18]TANG Juming, LELIEVR J, TUNG M A, et al. Polymer and ion concentration effects on gellan gel strength and strain[J]. Journal of Food Science, 1994, 59(1): 216-220.

[19]LAU M H, TANG J, PAULSON A T. Texture profile and turbidity of gellan/gelation mixed gels[J]. Food Research International, 2000, 33(8): 665-671.

[20]CHANDRASEKARAN R, MILLANE, R P, ARNOTT S, et al. The crystal structure of gellan[J]. Carbohydrate Research, 1988, 175(1): 1-15.

[21]NISSEN J A. Enzymatic hydrolysis of food protein[M]. London: Elsevier Applied Science Publishers Ltd., 1986: 38-42.

[22]ZHONG Fang, WANG Zhang, XU Shiying, et al. The evaluation of proteases as coagulants for soy protein dispersions[J]. Food Chemistry, 2007, 100(4): 1371-1376.

[23]陳莉, 鐘芳, 王璋. 凝固劑及凝固條件對大豆蛋白膠凝性質(zhì)的影響[J]. 中國乳品工業(yè), 2004, 32(9): 23-27.

[24]TANG Chuanhe, WU Hui, CHEN Zhong, et al. Formation and properties of glycinin-rich and β-conglycinin-rich soy protein isolate gels induced by microbial transglutaminase[J]. Food Research International, 2006, 39(1): 87-97.

[25]RENKMA J M S, KNABBEN J H M, van VLIET T. Gel formation by β-conglycinin and glycinin and their mixtures[J]. Food Hydrocolloids, 2001, 15(4): 1407-1414.

Effect of Inorganic Salts on Papain-Induced Coagulation of Soybean Protein Isolate

DA Jiu-xiang1，LI Ying-ying1，LUAN Guang-zhong1,2,*，CUI Ya-li1，HU Ya-yun1，LI Zhi-cheng1,2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Shaanxi Engineering Center of Agro-product Processing, Yangling 712100, China)

In order to explore the effect of inorganic salts on papain-induced coagulation of soybean protein, the changes of clotting time, texture properties, pH and protein degradation were determined during or after the coagulation of soybean protein isolate (SPI) in the presence of one of five salts including NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2and MgSO4. The results showed that the clotting time was shortened and gel strength was increased; the pH of SPI was reduced after the addition of salts. After papain was added, the pH revealed a continuous decrease to a steady level upon a certain time of incubation. Ca2+and Mg2+revealed more effective than Na+and K+on both clotting time and gel strength under the same ionic strength. The gel strength revealed an increase by 60% when the amount of papain was reduced to 0.1% from 0.15% (m/m). Therefore, the presence of salts could shorten clotting time and gel strength, and the addition of calcium or magnesium salts is an effective way to enhance the strength of papain-induced SPI gel.

salts；papain；soybean protein isolate；gel

TS201.7

A

1002-6630(2012)11-0030-05

2011-05-24

聯(lián)合國大學(xué)-麒麟繼續(xù)研究基金項目

笪久香(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為大豆蛋白深加工。E-mail：djx08930@163.com

*通信作者：欒廣忠(1968—)，男，副教授，博士，研究方向為植物蛋白深加工。E-mail：qlgz@nwsuaf.edu.cn