鄭 艷，匡立學(xué)，李 超，張玉龍*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

洋蔥假單胞菌乳糖酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄭 艷，匡立學(xué)，李 超，張玉龍*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

以選育的洋蔥假單胞菌NTG-15-03為生產(chǎn)菌株，通過(guò)單因素和回歸正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察菌株種齡、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵液初始pH值對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：在pH7.0、種齡24h、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間106h的條件下，該菌株的乳糖酸產(chǎn)量為10.08g/L。

乳糖酸；響應(yīng)面分析；發(fā)酵

乳糖酸(lactobionic acid，LA)是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖酸通過(guò)醚鍵連接起來(lái)的一種新型的多羥基有機(jī)酸[1]。它可以作為雙歧因子、礦質(zhì)元素吸收的促進(jìn)劑、甜味劑、酸味劑、器官移植的保存劑等[2-3]，廣泛的應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥和精細(xì)化工領(lǐng)域。盡管乳糖酸具有多種生理功能，但在我國(guó)并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。目前在美國(guó)和歐洲，乳糖酸的生產(chǎn)主要是采用化學(xué)合成法[4]。由于該方法在氧化過(guò)程中常伴有多種副產(chǎn)物生成，因此生產(chǎn)成本相對(duì)較高。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳糖酸的研究始于20世紀(jì)末，但尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。我國(guó)在此方面的研究尚屬空白。

本實(shí)驗(yàn)以選育的洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia) NTG-15-03為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素及回歸正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究，以期為乳糖酸的發(fā)酵生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥假單胞菌由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室分離，編號(hào)為菌株NTG-15-03。

乳糖酸 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Prominence LC-20A高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；Anke TDL-40B精密離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器 常州國(guó)華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

斜面培養(yǎng)基：乳糖10g、蛋白胨5g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.1g、瓊脂20g、蒸餾水1L，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖10g、玉米漿10g、蛋白胨1g、NaCl 2g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

1.3.2 菌種的活化

將低溫保藏的洋蔥假單孢菌NTG-15-03接種至新配制的斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)2d。將菌種反復(fù)活化3次后，置于冰箱中保藏。

1.3.3 乳糖酸的發(fā)酵

將活化好的種子培養(yǎng)液接種至含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，(30±1)℃恒溫振蕩培養(yǎng)96h。

1.3.4 乳糖酸含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定[6]，固定相：NH2P-50柱；檢測(cè)器：RID-10A示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈和40mmol/L Na2HPO4-20mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 5.0，體積比6:4，在0.8mL/min、40℃條件下泵入。

1.3.5 回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析方法：在Minitab 15軟件中，按照Minitab→統(tǒng)計(jì)→DOE→響應(yīng)曲面→創(chuàng)建響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)→中心復(fù)合的順序，對(duì)以上4個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化，進(jìn)行四因素三水平的31組中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)的中心編碼為0、0、0、0，試驗(yàn)的實(shí)際濃度選取單因素試驗(yàn)中乳糖酸產(chǎn)量最高的單因素?cái)?shù)值，即種齡20h、接種量2%、pH7.0、培養(yǎng)時(shí)間96h。

按照確定的各因素編碼水平和試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)中心復(fù)合試驗(yàn)，各因素編碼水平見(jiàn)表1。

表1 中心復(fù)合試驗(yàn)的編碼及水平Table 1 Factors and levels of central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株種齡對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響

將種齡分別為12、16、20、24、28h的菌株種子以2%的接種量接種至pH7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基中，4d后測(cè)定發(fā)酵液中乳糖酸的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株種齡對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of seed age on the yield of lactobionic acid

由圖1可知，隨著種齡的增加，乳糖酸產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。以種齡為20h的種子接種，發(fā)酵液中乳糖酸含量最高。

2.2 接種量對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響

圖2 接種量對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of lactobionic acid

接種量的大小直接影響乳糖酸的發(fā)酵產(chǎn)量，合適的接種量不僅可以提高產(chǎn)物的合成速率，也有利于減少染菌機(jī)會(huì)。以種齡為20h細(xì)胞作為種子，分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種至pH7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵4d，測(cè)定乳糖酸含量。由圖2可知，接種量為2%時(shí)發(fā)酵液中乳糖酸的產(chǎn)量最高；隨著接種量的增加乳糖酸的產(chǎn)量開(kāi)始下降，這主要是由于過(guò)大的接種量使得菌體細(xì)胞的數(shù)量增殖過(guò)快，營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)多，進(jìn)而影響到代謝產(chǎn)物的生成量。

2.3 pH值對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響

圖3 發(fā)酵液初始pH值對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH on the yield of lactobionic acid

不同的發(fā)酵初始pH值不僅可以影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性，同時(shí)也會(huì)影響代謝過(guò)程中酶的催化活性，進(jìn)而影響到乳糖酸的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)以種齡為20h細(xì)胞作為種子，以2%的接種量接種至不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵4d，測(cè)定乳糖酸產(chǎn)量。由圖3可知，在發(fā)酵液初始pH值為7.0時(shí)，乳糖酸產(chǎn)量最高，因此確定該菌株的發(fā)酵初始pH值為7.0。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of lactobionic acid

根據(jù)以上試驗(yàn)對(duì)種齡、接種量、pH值分別選擇最優(yōu)值，其他條件保持不變，分別發(fā)酵4 8、7 2、9 6、120、144h考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響。由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖酸產(chǎn)量增加，自96h以后，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖酸產(chǎn)量基本保持不變。

2.5 回歸正交試驗(yàn)

2.5.1 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果

表2 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and results

利用Design Expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得乳糖酸產(chǎn)量對(duì)pH值、種齡、接種量、發(fā)酵時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行顯著性驗(yàn)證和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of each regression coefficient in the established quadratic regression model

由表3可知，因素X3、X4、X32對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的曲面效應(yīng)影響極顯著，X2X4對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的曲面效應(yīng)影響顯著，其他對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響不顯著。說(shuō)明四因素均不同程度的對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生顯著或極顯著的影響，原回歸方程可化簡(jiǎn)為：

表4 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合的二次模型方差分析Table 4 Variance analysis for the yield of lactobionic acid under various fermentation conditions

由表4可知，模型回歸效果極顯著，多元相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9574，說(shuō)明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，可用來(lái)進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測(cè)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。

2.5.2 回歸模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析得到優(yōu)化培養(yǎng)條件：菌株種齡24h、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間106h、pH7.0。在此培養(yǎng)條件下洋蔥假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酸，得到的乳糖酸產(chǎn)量為10.08g/L，與模型預(yù)測(cè)值10.20g/L之間的誤差小于5%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了發(fā)酵液初始pH值、接種量、種齡、發(fā)酵時(shí)間對(duì)洋蔥假單胞菌NTG-15-03菌株發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酸產(chǎn)量的影響。單因素試驗(yàn)和回歸正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果表明：在pH 7.0、種齡24h、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間106h的條件下乳糖酸的產(chǎn)量為10.08g/L。

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Optimization of Fermentation Conditions for Lactobionic acid Production by Burkholderia cepacia

ZHENG Yan，KUANG Li-xue，LI Chao，ZHANG Yu-long*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The fermentation conditions of Burkholderia cepacia NTG-15-03 for the production of lactobionic acid were optimized using one-factor-at-a-time method and response surface analysis based on quadratic regression orthogonal design. The optimal fermentation conditions for the production of lactobionic acid were fermentation pH of 7.0, seed age of 24 h, inoculation amount of 2% and fermentation time of 106 h. Under these conditions, the yield of lactobionic acid was up to 10.08 g/L.

lactobionic acid；response surface analysis；fermentation

Q815

A

1002-6630(2012)11-0181-04

2011-05-15

鄭艷(1973—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhengyan0403@163.com

*通信作者：張玉龍(1955—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)資源利用。E-mail：ylzsau@163.com