薛海燕，李 韻，張小苗，符海英，鄒聯(lián)柱，宋宏新*

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

3種特異性IgY與IgG相對親和力特性的比較研究

薛海燕，李 韻，張小苗，符海英，鄒聯(lián)柱，宋宏新*

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

采用硫氰酸銨和尿素洗脫ELISA法兩種方法，分別對牛β-酪蛋白、κ-酪蛋白和大腸桿菌O157:H7與對應(yīng)抗原的卵黃抗體(IgY)與免疫球蛋白(IgG)抗體相對親和力特性進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明：3種特異性IgY與抗原的相對親和力比IgG要高，對蛋白抗原，兩種抗體的相對親和力相差不大，而對大腸桿菌O157:H7，兩種抗體的差別明顯加大，IgY的相對親和力較IgG強(qiáng)。兩類乳源蛋白抗體親和力比較，發(fā)現(xiàn)κ-酪蛋白抗體與抗原的親和力高于β-酪蛋白抗體，前者用于乳品免疫檢測中，可提高方法靈敏度。

酪蛋白；大腸桿菌O157:H7；相對親和力；卵黃抗體；IgG

卵黃免疫球蛋白(immnunoglobins of yolk，IgY)又稱卵黃抗體，與血清免疫球蛋白G (immnunoglobin G，IgG)是分別來源于卵黃和血清的兩種多克隆抗體，二者在結(jié)構(gòu)上有所不同，但均具有與抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)[1]，因此可普遍應(yīng)用于免疫檢測當(dāng)中。目前，這兩類抗體在微生物及其毒素、農(nóng)藥和抗生素殘留等的檢測方面應(yīng)用研究較多[2-6]。此外，利用這兩類抗體，通過免疫檢測技術(shù)對乳品質(zhì)量進(jìn)行分析的研究[7-9]。其中，基于乳源蛋白含量和比例的摻假檢測方法憑借其能檢測任何物質(zhì)摻假方式的優(yōu)勢具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。在食品質(zhì)量安全監(jiān)控中，大多數(shù)物質(zhì)可看作抗原，制備相應(yīng)抗體后，利用抗原抗體的免疫反應(yīng)進(jìn)行質(zhì)與量的檢測，則抗體的優(yōu)劣對于免疫檢測的結(jié)果將起到非常關(guān)鍵的作用[11-12]?？贵w的親和力特性反映的是抗體與抗原結(jié)合的牢固程度，是衡量抗體性能的一個重要指標(biāo)，也是捕獲或檢測用抗體選擇時需要考慮的關(guān)鍵因素。抗體親和力測定的實驗技術(shù)有很多，廣泛應(yīng)用的是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，該法簡單、快速，而且使用的抗體和抗原的量較少，還可無需純化抗體和抗原[13]。本研究利用硫氰酸銨和尿素洗脫ELISA法對抗牛β-酪蛋白(βcasein，β-CN)、κ-酪蛋白(κ-casein，κ-CN)、大腸桿菌O157:H7 (Escherichia coli O157:H7)的IgY與IgG三組抗體與相應(yīng)抗原的親和力進(jìn)行對比考察，為該食源性疾病病原菌及乳品質(zhì)量分析抗體選擇提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HRP標(biāo)記羊抗兔IgG與HRP標(biāo)記兔抗雞IgG 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；牛β-酪蛋白與κ-酪蛋白美國Sigma公司；大腸桿菌O157:H7 本實驗保藏；四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 美國Amresco公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Electron公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；多道移液器芬蘭雷勃公司；微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；PB-10型酸度計 德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 IgY與IgG的制備

分別以β-CN、κ-CN、E.coli O157:H7為抗原，免疫健康臨產(chǎn)蛋母雞與雄性新西蘭兔制備IgY與IgG抗體，每一種抗原免疫3只動物，設(shè)1只動物用生理鹽水替代抗原免疫作為陰性對照。IgY抗體的制備及分離純化參見文獻(xiàn)[14]，IgG抗體的制備及分離純化參見文獻(xiàn)[15]。純化后經(jīng)間接ELISA及電泳檢測，3種IgY抗體的效價分別為1:2000、1:2000、1:4000，純度達(dá)到90%以上；3種IgG抗體的效價分別為1:4000、1:4000、1:8000，純度達(dá)到95%以上。

1.2.2 親和力測定時最佳抗原包被濃度的確定

采用ELISA的基本方法對IgY及IgG兩種抗體的相對親和力進(jìn)行衡量，因此首先確定兩種抗體在進(jìn)行ELISA效價測定時的最佳抗原包被濃度。結(jié)果顯示，牛β-CN、κ-CN和E.coli O157:H7這3種抗原在測定IgY時最佳包被濃度分別為25μg/mL、25μg/mL和109CFU/mL，測定IgG時分別為6.25μg/mL、1.5625μg/mL和108～109CFU/mL。

1.2.3 硫氰酸銨洗脫法測定兩種抗體的相對親和力

參照文獻(xiàn)[16]，結(jié)合所測抗體的特性，稍作改進(jìn)，分別測定兩種β-CN、κ-CN、E.coli O157:H7的抗體(IgY及IgG)的相對親和力。生理鹽水免疫所獲雞蛋提取IgY或兔血清為陰性對照，每種抗原設(shè)置3組平行實驗，所得結(jié)果OD450nm值為3組平均值。ELISA檢測方法如下：

根據(jù)公式(1)計算抗體保留率，并繪制硫氰酸銨濃度與抗體保留率的關(guān)系曲線。

式中：(OD450nm)i、 (OD450nm)m分別為添加和未添加硫氰酸銨洗脫時的OD450nm值。

1.2.4 尿素洗脫法測定兩種抗體的相對親和力指數(shù)

尿素洗脫法曾是醫(yī)學(xué)上用于測定血液中抗病毒IgG親和力的方法[17]，本實驗借鑒此方法，參考Condorelli等[18]的研究設(shè)計實驗，該方法與硫氰酸銨洗脫法類似，只是以300μL 8mol/L尿素替代硫氰酸銨，常溫靜置3min對抗體進(jìn)行解離，重復(fù)尿素洗滌過程兩次，其余同硫酸氰胺法。設(shè)置對照孔以ELISA洗滌液PBST進(jìn)行洗滌，利用公式(2)計算抗體的相對親和力指數(shù)。

式中：(OD450nm)urea為尿素洗脫孔的OD450nm值；(OD450nm)PBST為PBS-吐溫洗脫孔的OD450nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫氰酸銨洗脫法測定相對親和力結(jié)果

2.1.1 兩種β-CN抗體親和力的比較

對兩種β-CN抗體，經(jīng)不同濃度硫氰酸銨洗脫后，得到硫氰酸銨濃度與抗體保留率的關(guān)系曲線，如圖1所示。隨硫氰酸銨濃度增大，兩種抗體的保留率均有一個較迅速的下降過程，在硫氰酸銨濃度小于3mol/L 時，IgY的曲線整體位于IgG的之上，這表明此時用相同濃度的硫氰酸銨處理β-CN抗原抗體復(fù)合物時，IgY抗體的保留率更大，它與β-CN抗原結(jié)合的更牢固，其親和力相對IgG抗體更高；用量在3～5mol/L之間，兩者保留率相差不大且處于平臺期，可能為兩種抗原抗體復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上具有一定的協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)濃度達(dá)到6mol/L時，IgG的保留率幾乎為0，即幾乎全部的復(fù)合物被解離，而與IgY抗體形成的復(fù)合物具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖1 抗β-CN抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系曲線Fig.1 Relationship between ammonium thiocyanate concentration and the retention rate of antiβ-CN antibody

2.1.2 兩種κ-CN抗體親和力比較

圖2 抗κ-CN抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系曲線Fig.2 Relationship between ammonium thiocyanate concentration and the retention rate of antiκ-CN antibody

對兩種κ-CN抗體經(jīng)硫氰酸銨洗脫后，測得抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系如圖2所示。IgY的曲線同樣在IgG曲線之上，因此，可知IgY抗體與其相應(yīng)抗原κ-CN的結(jié)合程度比IgG抗體更為緊密，不易被硫氰酸銨洗脫，IgY對相應(yīng)抗原的親和力比IgG強(qiáng)。同時，經(jīng)圖1與圖2曲線的比較可知，當(dāng)無論是IgY抗體或IgG抗體，抗κ-CN抗體保留率降至50%時，硫氰酸銨的濃度約在4.5mol/L以上，而抗β-CN抗體降至相同程度時，硫氰酸銨濃度約小于2mol/L，這說明抗β-CN抗體對硫氰酸銨的洗脫作用更為敏感，其與對應(yīng)抗原的結(jié)合能力相對較弱。即制備所得抗κ-CN抗體親和力大于抗β-CN抗體。當(dāng)以牛乳酪蛋白檢測對象時，選擇κ-CN及其抗體為捕獲抗體，不易受到乳中其他物質(zhì)的干擾，可提高檢測靈敏度。

2.1.3 抗大腸桿菌O157:H7抗體親和力比較

圖3 抗大腸桿菌O157:H7抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系曲線Fig.3 Relationship between ammonium thiocyanate concentration and the retention rate of anti-E. coli O157:H7 antibody

硫氰酸銨濃度與抗大腸桿菌O157:H7抗體保留率的關(guān)系曲線如圖3所示。在洗脫用硫氰酸銨濃度一致條件下，IgY的保留率基本都比IgG大，隨硫氰酸銨的濃度的增加，IgY與IgG的相對親和力差異增加，IgY與E.coli O157:H7形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。當(dāng)IgY抗體保留率降至50%時，硫氰酸銨的濃度為4mol/L，而對IgG只需用2mol/L硫氰酸銨洗脫就能達(dá)到同樣的效果。這表明IgY抗體與E.coli O157:H7抗原的結(jié)合能力較IgG強(qiáng)，IgY在親和力特性方面較IgG具有優(yōu)勢。與蛋白抗原相比，菌體抗原對應(yīng)的兩種抗體與抗原的結(jié)合力能力相差更大。IgY更適于菌體抗原的捕獲檢測。

2.2 尿素洗脫法測定3組特異性抗體的相對親和力指數(shù)結(jié)果

由表1可知，抗β-CN、κ-CN和E.coli O157:H7 IgY的相對親和力指數(shù)都在79%以上，而相應(yīng)的3種IgG的相對親和力指數(shù)在60%以下，因此，3種特異性IgY與其相應(yīng)抗原的結(jié)合更為牢固，受尿素洗脫的影響較小，其與對應(yīng)抗原親和力比IgG強(qiáng)，這與硫氰酸銨洗脫法測定得到的結(jié)論是一致的。

3 結(jié) 論

利用硫氰酸銨和尿素洗脫ELISA法對抗β-CN、κ-CN和大腸桿菌O157:H7的IgY和IgG抗體的相對親和力進(jìn)行了比較研究，3種抗原對應(yīng)的特異性IgY在相對親和力特性方面均優(yōu)于IgG抗體，在多克隆抗體的應(yīng)用研究中，可采用IgY進(jìn)行替代IgG，同時還具有抗體產(chǎn)生量大、易收集、利于動物福利等優(yōu)點。對于兩種抗乳源蛋白抗體，κ-CN抗體的相對親和力較強(qiáng)，采用免疫吸收等方法減小交叉反應(yīng)性后，較適用于乳樣品的特異性或牛羊乳摻假區(qū)別檢測。相對而言，硫氰酸銨洗脫ELISA法能夠得到一個相對親和力的參考區(qū)間范圍，能夠更好的考察抗原抗體復(fù)合的整體結(jié)合能力及變化趨勢?？贵w的親和力是決定抗體優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)，簡單易行的相對親和力檢測方法為抗體的深入應(yīng)用研究建立良好開端，同時本實驗為免疫檢測中抗體的選擇提供了重要的參考依據(jù)。

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Comparative Study on Relative Affinity of Three Types of Specific IgY and IgG

XUE Hai-yan，LI Yun，ZHANG Xiao-miao，F(xiàn)U Hai-ying，ZOU Lian-zhu，SONG Hong-xin*
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

The relative affinity of anti-bovine β-casein, κ-casein, E. coli O157:H7 IgY and IgG with their corresponding antigens was investigated using ammonium sulfocyanate and urea elution ELISA methods. The results indicated that three kinds of IgY had higher relative affinity with their corresponding antigens when compared to IgG. A significant difference between IgY and IgG against E. coli O157:H7 was observed, whereas slight differences were found for β-casein and κ-casein. Besides, the affinity of κ-casein with its corresponding antibodies showed an increase when compared to β-casein. Therefore, anti-κ-casein antibody is more suitable for the detection of milk samples than anti-β-casein antibody.

casein；Escherichia coli O157:H7；relative affinity；IgY；IgG

TS207.3

A

1002-6630(2012)11-0163-04

2011-08-04

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2012JM2009)；陜西省教育廳自然科學(xué)專項(2010JK425)；陜西科技大學(xué)自然科學(xué)基金項目(ZX10-22)

薛海燕(1979—)，女，講師，碩士，研究方向為食品免疫檢測技術(shù)。E-mail：xuehaiyan@sust.edu.cn

*通信作者：宋宏新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：songhx@sust.edu.cn