張 麗，張 磊，康 樂(lè)，王軍偉，王 魯，龔達(dá)平，劉貫山*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.云南煙草集團(tuán)（有限）責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase/calmodulin-like domain protein kinase,CDPK）普遍存在于植物、藻類(lèi)及部分原生動(dòng)物中，廣泛分布于植物的各種組織且在空間表達(dá)存在明顯差異。CDPK基因的同系物眾多，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相對(duì)保守，均含有N端可變區(qū)、ATP結(jié)合的激酶區(qū)、自我抑制區(qū)和類(lèi)鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[1-4]。CDPK的 N端可變區(qū)可能通過(guò)識(shí)別不同的底物來(lái)影響不同的CDPK亞型參與植物的碳氮代謝、離子和水分跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞骨架、氣孔運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程[5-6]。CDPK還參與植物的生物和非生物脅迫過(guò)程，例如小麥中有9個(gè)CDPK基因與小麥白粉病有關(guān)，TaCPK4對(duì)鹽害、冷害、ABA和GA處理均有反應(yīng)[7]；擬南芥AtCPK12對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)過(guò)程的ABA信號(hào)起負(fù)調(diào)控作用[8]，AtCPK6參與保衛(wèi)細(xì)胞的甲基茉莉酸信號(hào)的正調(diào)控過(guò)程[9]；普通煙草 NtCDPK12可能參與煙草干旱和鹽害有關(guān)的生理過(guò)程[10]。綜上所述，CDPK基因與植物的逆境反應(yīng)存在一定的聯(lián)系。普通煙草（Nicotiana tabacum）可能是林煙草（Nicotiana sylvestris）和絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）天然雜交的F1染色體自然加倍而形成的[11]。研究絨毛狀煙草和林煙草的 CDPK基因，不僅有利于研究普通煙草CDPK基因及絨毛狀煙草、林煙草與普通煙草的進(jìn)化關(guān)系，還可以為不同的CDPK亞型與生物和非生物脅迫之間的聯(lián)系提供條件。本研究通過(guò)檢索絨毛狀煙草基因組框架圖數(shù)據(jù)庫(kù)，分離得到絨毛狀煙草的CDPK基因，分析該基因家族成員的序列特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特性，為在基因組范圍內(nèi)研究絨毛狀煙草CDPK基因家族功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為溫室內(nèi)培養(yǎng)的絨毛狀煙草。采集4～5片真葉期的絨毛狀煙草的根、莖、葉以及生殖生長(zhǎng)期的花，經(jīng)液氮速凍后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源

用擬南芥、普通煙草和煙草屬其他種的CDPK基因序列檢索絨毛狀煙草基因組框架圖數(shù)據(jù)庫(kù)。將分離得到CDPK基因進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證，并手工進(jìn)行校正。BLAST搜尋時(shí)使用默認(rèn)參數(shù)，并隨時(shí)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行核酸水平和蛋白質(zhì)水平的同源性比對(duì)，以驗(yàn)證候選序列的準(zhǔn)確性。應(yīng)用NCBI的ORF finder軟件對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行可讀框架分析。

1.3 基因結(jié)構(gòu)分析

利用Gene Structure Display Server（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/chinese.php）在線軟件對(duì)絨毛狀煙草CDPK的 CDS序列和對(duì)應(yīng)的全基因組序列進(jìn)行分析，從而繪出基因結(jié)構(gòu)圖[12]。

1.4 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用在線分析軟 SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）和 Plantsp Feature Scan（http://plantsp.genomics.purdue.edu/）預(yù)測(cè)絨毛狀煙草CDPK基因家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[13]。參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

1.5 基因GC含量計(jì)算

用geecee(http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program)軟件計(jì)算絨毛狀煙草CDPK基因的GC含量，并用cpgplot（http://weblab.cbi.pku.edu.cn/program）軟件對(duì)絨毛狀煙草、普通煙草及擬南芥的CDPK直系同源基因的GC含量進(jìn)行比較。

1.6 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

以普通煙草的 NtCDPK1編碼的蛋白質(zhì)序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，利用ClustalW2軟件對(duì)絨毛狀煙草CDPK家族的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。以多序列比對(duì)的結(jié)果為基礎(chǔ)，用Mega軟件（版本4.1）進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)校驗(yàn)生成無(wú)根進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)生成采用neighbor-joining方法，由 1000次自舉值重復(fù)抽樣組成[14]。

1.7 主坐標(biāo)分析

用主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis, PCO）在線分析軟件（http://pbil.univ-lyon1.fr/ mva/ pco.php）對(duì)多序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

1.8 基因表達(dá)分析

使用TIANGEN TRNzol-A+總RNA提取試劑盒分別提取絨毛狀煙草根、莖、葉和花的總RNA，用 DNaseⅠ（TIANGENG，北京）處理，采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa）合成 cDNA第一鏈。以煙草核糖體蛋白基因（NtL25,GenBank accession no.L18908）為內(nèi)參基因[15]，定量PCR反應(yīng)的模板的濃度，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共 35 循環(huán)，最后 72 ℃ 10 min。針對(duì)絨毛狀煙草CDPK基因特異的區(qū)域設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共 35 循環(huán)，最后 72 ℃10 min。

表1 引物及序列Table1 Primers used in this study

2 結(jié) 果

2.1 絨毛狀煙草CDPK基因的結(jié)構(gòu)特征

對(duì)絨毛狀煙草基因組框架圖數(shù)據(jù)庫(kù)（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，數(shù)據(jù)未公開(kāi)）進(jìn)行檢索，共獲得 25個(gè) CDPK基因，并將它們命名為 NtoCPKX（Nicotiana tomentosiformis calcium-dependent protein kinase X, X代表1, 2, 3, … , 25）。通過(guò)對(duì)絨毛狀煙草25個(gè)CDPK基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)亞家族Ⅳ中的內(nèi)含子個(gè)數(shù)與其它3個(gè)家族存在著明顯差異：亞家族Ⅰ-Ⅲ中的內(nèi)含子個(gè)數(shù)大多為 6～9個(gè)，而亞家族Ⅳ中的NtoCPK19和NtoCPK6的內(nèi)含子個(gè)數(shù)分別為14和11（圖1、表2）。這些內(nèi)含子可分為3種類(lèi)型[3]：相位數(shù)為0的內(nèi)含子（插入到2個(gè)密碼子之間的內(nèi)含子），相位數(shù)為1的內(nèi)含子（插入到1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基的內(nèi)含子）和相位數(shù)為2的內(nèi)含子（插入到1個(gè)密碼子的第2個(gè)堿基的內(nèi)含子）。研究表明其內(nèi)含子的插入位置相對(duì)是保守的，大部分內(nèi)含子的插入位置位于蛋白激酶區(qū)。同一家族基因的內(nèi)含子個(gè)數(shù)和插入位置保守性較高，這說(shuō)明它們的同源性高，進(jìn)化關(guān)系近。

2.2 絨毛狀煙草CDPK的序列特征和蛋白結(jié)構(gòu)域

絨毛狀煙草CDPK家族成員具有典型CDPK的特征，從N端到C端的結(jié)構(gòu)域依次為N端可變區(qū)、ATP結(jié)合的激酶區(qū)、自我抑制區(qū)和類(lèi)鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)（圖形未列出）。大多數(shù)絨毛狀煙草CDPK的類(lèi)鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)含有4個(gè)保守的EF手性鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但NtoCPK10和NtoCPK24僅有3個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)域（表2）。由SMART軟件分析結(jié)果可知，絨毛狀煙草 CDPK家族成員都有明顯的 Ca2+/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的激酶區(qū)以及類(lèi)似于鈣調(diào)素的鈣結(jié)合區(qū)?？梢?jiàn)，這 25個(gè)NtoCPKs具有典型的CDPK基因編碼產(chǎn)物的特征，即我們分離得到了25個(gè)完整的CDPK基因。

圖1 絨毛狀煙草CDPK基因家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of CDPK gene family in N.tomentosiformis

表2 絨毛狀煙草CDPK的特征Table2 Characteristics of CDPKs in N.tomentosiformis

CDPK的N末端在氨基酸序列和氨基酸長(zhǎng)度上差異較大，如擬南芥CDPK的N末端的氨基酸長(zhǎng)度從25(AtCPK11) 到約200(AtCPK2)不等。但在一定條件下，其N(xiāo)末端的甘氨酸殘基能被豆蔻酸共價(jià)修飾從而促進(jìn)其與膜結(jié)合。由表2可知，絨毛狀煙草中有16個(gè)CDPK的N末端均含有豆蔻?；?，11個(gè)CDPK含有潛在的跨膜區(qū)。

2.3 絨毛狀煙草CDPK基因的GC含量

大多數(shù)絨毛狀煙草CDPK基因GC的含量位于41%～43%（表2），平均值為41.64%，它與擬南芥的GC含量均值42.1%很接近。此外，通過(guò)cpgplot軟件對(duì)NtoCPK2、11和12與普通煙草及擬南芥中的直系同源基因進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，直系同源基因的GC含量隨序列長(zhǎng)度的變化趨勢(shì)整體上是一致的（圖2）。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

圖2 絨毛狀煙草、普通煙草和擬南芥部分CDPK直系同源基因的GC含量Fig.2 GC contents of orthologous CDPK genes from N.tomentosiformis, N.tabacum and Arabidopsis

圖3 絨毛狀煙草、普通煙草和擬南芥CDPK構(gòu)建的鄰接樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining tree of N.tabacum, N.tomentosiformis and Arabidopsis CDPKs

對(duì)25個(gè)絨毛狀煙草、13個(gè)普通煙草和34個(gè)擬南芥CDPK構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）?？梢钥闯?，與擬南芥和普通煙草一樣，絨毛狀煙草的全部CDPK分布于4個(gè)組（亞家族）中，組Ⅱ和Ⅲ又可以進(jìn)一步分為2個(gè)亞組。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，絨毛狀煙草CDPK多數(shù)位于亞家族Ⅰ（10個(gè)）中、Ⅱ（6個(gè)）和Ⅲ（7個(gè)）中次之，亞家族Ⅳ（2個(gè)）中最少。普通煙草是異源四倍體，可能起源于林煙草和絨毛狀煙草2個(gè)二倍體種[11]。在絨毛狀煙草和普通煙草中，2對(duì) CDPK即 NtoCPK1/NtCDPK7和NtoCPK22/NtCDPK8的一致性達(dá)到 99.0%以上；8對(duì) CDPK即 NtoCPK2/NtCDPK5、NtoCPK5/NtCDPK9、NtoCPK6/NtCPK4、NtoCPK8/NtCDPK3、NtoCPK9/NtCDPK11、NtoCPK12/NtCDPK12、NtoCPK17/NtCDPK6以及NtoCPK21/NtCDPK2的一致性均達(dá)到90%以上。這說(shuō)明普通煙草的這10個(gè)CDPK基因可能與絨毛狀煙草對(duì)應(yīng)的10個(gè)CDPK基因是直系同源基因，特別是與絨毛狀煙草蛋白序列同源性達(dá)到 99%以上的2個(gè)普通煙草的CDPK基因可能來(lái)源于絨毛狀煙草。

2.5 主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析（PCO）可用于多個(gè)序列的分類(lèi)[16]。如果分析的序列很多時(shí)，可將主坐標(biāo)分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)相結(jié)合，從而更好地推斷各亞家族之間的進(jìn)化關(guān)系[17]。由主坐標(biāo)分析可知，絨毛狀煙草、普通煙草和擬南芥的CDPK可分為4類(lèi)群，與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的4個(gè)亞家族相吻合（圖4）?？梢钥闯?，亞家族Ⅳ中的NtoCPK6和19位于一個(gè)類(lèi)群，且與其它的絨毛狀煙草CDPK距離很遠(yuǎn)，說(shuō)明這兩個(gè)基因的進(jìn)化速度最快。亞家族Ⅰ和亞家族Ⅱ的距離很近，說(shuō)明這兩個(gè)家族的CDPK基因可能來(lái)源于共同的祖先。亞家族Ⅲ與其他亞家族的距離都較遠(yuǎn)，說(shuō)明其進(jìn)化速度比亞家族Ⅰ和亞家族Ⅱ快，但比亞家族Ⅳ慢。亞家族Ⅲ中的 CDPK可分為 2個(gè)小類(lèi)群，其中NtoCPK7和AtCDPK24屬于同一小類(lèi)群，與亞家族Ⅲ的其它成員具有一定的距離，表明這2個(gè)基因的進(jìn)化速度與同家族的其它基因相差較大。

圖4 普通煙草、絨毛狀煙草和擬南芥CDPK基因家族的PCO分析Fig.4 The principal coordinates analysis of N.tabacum,N.tomentosiformis and Arabidopsis proteins

2.6 絨毛狀煙草CDPK基因的表達(dá)分析

圖5 絨毛狀煙草CDPK基因家族表達(dá)譜Fig.5 Expression patterns of CDPK gene family in N.tomentosiformis

采用RT-PCR分析25個(gè)CDPK基因在根、莖、葉和花4個(gè)部位（組織）中表達(dá)情況。結(jié)果表明，25個(gè)絨毛狀煙草CDPK基因呈現(xiàn)出4種不同的組織特異性表達(dá)模式（圖5）。第一，在所有4個(gè)組織中都有表達(dá)且沒(méi)有明顯的差異，屬于泛表達(dá)基因（NtoCPK2、7、8、9、10、14 和 21）。第二，主要在3個(gè)組織中表達(dá)，而在其余1個(gè)組織中表達(dá)量很低或幾乎檢測(cè)不到，其中NtoCPK4、20和24主要在根、莖和葉中表達(dá)；NtoCPK5和22主要在根、葉和花中表達(dá)；NtoCPK19主要在根、莖和花中表達(dá)。第三，主要在2個(gè)組織中表達(dá)，而在其余2個(gè)組織中表達(dá)量很低或幾乎檢測(cè)不到，其中NtoCPK17主要在根和莖中表達(dá)；NtoCPK6和25主要在根和葉中表達(dá)；NtoCPK1主要在莖和花中表達(dá)；NtoCPK12、13、15和23主要在葉和花中表達(dá)。第四，主要在1個(gè)組織中表達(dá)，而在其余3個(gè)組織中表達(dá)量很低或幾乎檢測(cè)不到，NtoCPK3主要在根中表達(dá)；NtoCPK16主要在葉中表達(dá)；NtoCPK11和18主要在花中表達(dá)。CDPK基因的這種不同組織特異性表達(dá)模式說(shuō)明，不同CDPK發(fā)揮功能作用的組織是不同的。

3 討 論

到目前為止，在普通煙草中已報(bào)道了 15個(gè)CDPK基因，其中13個(gè)具有全長(zhǎng)序列。由于CDPK是個(gè)多基因家族，從目前已知擬南芥 34個(gè)、水稻31個(gè)、小麥至少26個(gè)以及本研究所得25個(gè)絨毛狀煙草CDPK來(lái)看，推測(cè)普通煙草中的CDPK至少有25 個(gè)以上[1,7,15,18]。

調(diào)控區(qū)即鈣結(jié)合區(qū)，具有Ca2+結(jié)合的EF手性結(jié)構(gòu)。研究表明擬南芥和水稻中均存在少于4個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)域的 CDPK亞型[1,18-19]。例如，在擬南芥中共有9個(gè)CDPK的EF手性結(jié)構(gòu)少于4個(gè)，其中AtCPK7、8、10、14、19、23 和 32 具有 3個(gè)，AtCPK13和25分別含有2和1個(gè)[1]；水稻OsCPK5和25含有 3個(gè)，而 OsCPK6只有 1個(gè)[18]。絨毛狀煙草NtoCPK10和24僅有3個(gè)。小麥和普通煙草中尚未發(fā)現(xiàn)少于4個(gè)的亞型。對(duì)AtCPK6進(jìn)行人為突變減少其 EF手性結(jié)構(gòu)，其激酶活性僅為野生型的11.6%～21.4%[20]；而水稻中有關(guān)于 EF手性結(jié)構(gòu)的突變對(duì)其激酶活性無(wú)明顯影響的報(bào)道[21]。因而 EF手性鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變對(duì)激酶活性的影響仍需進(jìn)一步深入研究。

CDPK的N末端可變區(qū)含有亞細(xì)胞定位信息，且大部分 CDPK與各種膜系統(tǒng)均有關(guān)聯(lián)[13]。據(jù)預(yù)測(cè)，擬南芥、水稻、小麥中具有N豆蔻?；虻腃DPK分別有24、15和2個(gè)[1,7,18]。16個(gè)絨毛狀煙草CDPK基因含有該基序，且11含有潛在的跨膜區(qū)（表2）。試驗(yàn)表明，AtCPK2的N末端甘氨酸殘基能豆蔻?；翌^ 10個(gè)氨基酸對(duì)于定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上很重要[22]。因此，我們推測(cè)絨毛狀煙草CDPK與膜系統(tǒng)存在一定的聯(lián)系。

絨毛狀煙草的CDPK基因的GC含量與擬南芥相近，而低于小麥和水稻CDPK基因的GC含量。這可能是因?yàn)閿M南芥和絨毛狀煙草是雙子葉植物，而小麥和水稻是單子葉植物。

通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，可用于分析分子之間的起源關(guān)系，并預(yù)測(cè)其功能[23]，位于同一亞家族或小分枝上的CDPK可能具有相似的功能。在已克隆的13個(gè)普通煙草全長(zhǎng)CDPK基因中除NtCDPK1和5外均在絨毛狀煙草 CDPK基因中找到了直系同源基因，其中NtCDPK7和8可能來(lái)源于絨毛狀煙草。直系同源基因可能具有相似的表達(dá)特性及功能，例如 NtoCPK2與 NtCDPK5均在不同組織中泛表達(dá)[15]；NtCDPK12受干旱和高鹽脅迫[10]，因此可以推測(cè) NtoCPK12也具有類(lèi)似的脅迫反應(yīng)。通過(guò)計(jì)算KA/KS值，NtCDPK5/AtCPK3和NtCDPK6/AtCPK13是2對(duì)直系同源基因[15]，所以NtoCPK2/AtCPK3與NtoCPK17/AtCPK13也可能是2對(duì)直系同源基因。AtCPK3與氣孔中 ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[24]，推測(cè)NtoCPK2在絨毛狀煙草中也有類(lèi)似的功能。另外，由圖3還可以看出，NtoCPK4/18、NtoCPK10/13、NtoCPK16/23和NtoCPK24/25可能是4對(duì)旁系同源基因，每對(duì)旁系同源基因在絨毛狀煙草中可能具有相似的功能。

植物中CDPK基因的空間表達(dá)模式可以分為3類(lèi)[25]。第1類(lèi)存在明顯的組織特異性，在某一組織中特異表達(dá)；第2類(lèi)在不同的組織中均有表達(dá)，但沒(méi)有明顯的差異；第3類(lèi)在所有的組織中都能檢測(cè)到，但表達(dá)量有著明顯的差異，主要在某一組織中表達(dá)。通過(guò)絨毛狀煙草及小麥[7]基因組范圍的CDPK基因的空間表達(dá)分析可知，還存在第4類(lèi)空間表達(dá)模式，即主要在2個(gè)或2個(gè)以上組織中表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)量很低或幾乎檢測(cè)不到。

4 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)方法從絨毛狀煙草基因組框架圖數(shù)據(jù)庫(kù)中共分離得到25個(gè)CDPK基因，其氨基酸序列與擬南芥和普通煙草的CDPK基因家族具有很高的同源性。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和主坐標(biāo)分析可知，這25個(gè)CDPK位于4個(gè)亞家族。RT-PCR分析表明，絨毛狀煙草CDPK基因家族呈現(xiàn)出4種不同的組織特異性表達(dá)模式。

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