朱忠彬，吳秉奇，丁延芹，陳曉明，張長華，杜秉海，王玉軍

（1.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東 泰安 271018；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018）

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，對我國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著舉足輕重的作用[1-3]。但自上世紀(jì) 90年代以來，煙草生產(chǎn)中由于過量施用化肥帶來的環(huán)境污染和土質(zhì)下降等問題日益突出[4]。煙草是葉用經(jīng)濟(jì)作物，對煙草的外觀和內(nèi)在質(zhì)量有特殊的要求，農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性以及對卷煙衛(wèi)生的影響，限制了農(nóng)藥的大規(guī)模利用，同時也不利于煙葉的出口[5]。因此以植物根際促生細(xì)菌（PGPR）為主的微生物制劑成為目前煙草種植中研究的熱點之一。一方面，PGPR能夠改善植物對礦物質(zhì)元素和水分的吸收、改變植物激素平衡、改善根部環(huán)境，且可以通過產(chǎn)生生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯、維生素及其他植物生長調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)植物的生長[6-8]；另一方面，PGPR還可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（ISR）[9]，使煙草具有對多種病害的抵抗能力，在煙草生產(chǎn)中具有十分重要的意義。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有促生能力的 PGPR菌株，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）RB242和 RB289能夠有效促進(jìn)煙草生長[10]，從印度西部森林分離的Bacillus thioparus NII-0902表現(xiàn)出多種植物的促生活性[11]，Bacillus vallismortis EXTN-1能夠觸發(fā)馬鈴薯等植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，提高馬鈴薯抗病毒PVY和PVX能力，增加葉綠素含量[12]。目前大多數(shù)的報道局限于PGPR的促生防病效果，其誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)抗性及對煙草生理指標(biāo)的影響等方面的研究仍少見報道。

本研究在溫室條件下研究PGPR菌株短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3對煙草生長發(fā)育的影響，探討其對煙草系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)作用，旨在為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用PGPR制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 盆栽試驗土壤 取自泰安當(dāng)?shù)剞r(nóng)田，每盆裝土大約10 kg，土壤理化性質(zhì)為：全氮5.47 g/kg，全磷1.01 g/kg，全鉀6.03 g/kg，有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)含量分別為8.81 mg/g和2.10 mg/g，速效磷、速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量分別為82.26、78.54、5.79和55.31 mg/kg，pH為7.54。

1.1.2 肥料 美康田佳牌復(fù)合肥（山東康田化肥有限公司），總有效成分≥40%，其中N:P:K=20:10:10，按照5 g/盆用量溶解后澆灌于土壤中。

1.1.3 品種 煙草品種為 K326，在育苗基質(zhì)中培育至5～6片真葉，備用。

1.1.4 供試菌種 分離自貴州煙田根際土壤的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3，實驗室條件下對煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）具有強(qiáng)烈的拮抗作用[13]。

1.1.5 培養(yǎng)基 菌株活化采用 LB培養(yǎng)基，DZQ3搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基（黃豆芽 200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 DZQ3活化后 30 ℃、170 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 3 d，用無菌水稀釋成 1×108CFU/mL。

1.2.2 盆栽試驗設(shè)計 試驗在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校本部日光溫室內(nèi)進(jìn)行，選擇長勢一致的煙苗，移栽前將煙草幼苗在1×108CFU/mL濃度的DZQ3菌液中浸根30 min，然后將煙苗移栽至盆中。緩苗3 d后用移液槍頭將DZQ3菌懸液（1×108CFU/mL）灌入煙株根際土壤，每株煙4 mL菌液，同時取1 mL菌液淋于莖基部。對照采用清水按同樣的方法處理，其余按照溫室常規(guī)管理。5次重復(fù)，每重復(fù)3株煙。

1.2.3 DZQ3促生效果調(diào)查 煙株移栽后30、60、90 d時調(diào)查農(nóng)藝性狀。種植期結(jié)束后，取出植株用清水洗凈，風(fēng)干后測定煙株鮮重。將煙株置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測整株干重。

1.2.4 煙草葉片生理指標(biāo)的測定 煙株移栽后30、60、90 d時，取從上至下數(shù)第4片展開的葉片，剪碎混合均勻后測定以下指標(biāo)，3次重復(fù)取平均值。葉綠素含量、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性參照文獻(xiàn)[14]的方法測定，多酚氧化酶（PPO）活性采用高峻鳳的方法測定[15]，過氧化氫酶（CAT）采用過氧化氫分解量法測定[16]，電解質(zhì)相對滲透率用電導(dǎo)法測定[16]。

1.2.5 煙草根系發(fā)育情況測定 生長期結(jié)束后，移出整個煙株，用清水洗凈風(fēng)干后稱鮮重，計算根冠比。根系活力的測定采用TTC法[17]。

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 DZQ3對煙草生長發(fā)育的影響

從圖1可以看出，接種拮抗菌DZQ3的煙株長勢優(yōu)于對照，處理煙株的莖圍、最大葉寬、最大葉面積和對照間差異較為明顯。移栽30 d后，DZQ3處理的煙株莖圍、最大葉寬、最大葉面積3項指標(biāo)分別比對照高出 16.79%、15.01%、24.56%，差異顯著；移栽60 d后，DZQ3處理煙株只有莖圍與對照差異達(dá)顯著水平，比對照高出16.52%；移栽90 d時，DZQ3處理煙株莖圍和最大葉寬分別比對照高出11.34%、24.23%，差異顯著。由此可見，接種拮抗菌DZQ3對煙草早期的生長發(fā)育起到明顯的促進(jìn)作用，有利于煙株莖圍增粗和葉面積增大，在煙草旺長期時處理間差距不是很明顯，而在后期又表現(xiàn)出一定的差距。同時可以看出，DZQ3處理煙株的莖圍與對照間的差距在整個生長期均可達(dá)到顯著水平，而DZQ3對株高、葉數(shù)、最大葉長三項指標(biāo)的影響不大，雖然各生長期相比于對照能夠表現(xiàn)出一定的生長優(yōu)勢，但差異不顯著。

由表1可以看出，DZQ3對煙草生物量的影響較大，接種拮抗菌的煙株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相比于對照均有增大的趨勢，尤其是煙株鮮質(zhì)量，比對照增加38.48%，差異顯著，但在干質(zhì)量方面雖然比對照高出9.55%，差異并不顯著。

2.2 煙草葉片系統(tǒng)抗性相關(guān)生理指標(biāo)

圖1 不同生長期各處理煙株農(nóng)藝性狀Fig.1 Agronomic traits of tobacco of each treatment in different growth phase

表1 各處理煙株生物量Table1 Biomass of tobacco

表2 拮抗菌對煙草葉片部分生理指標(biāo)的影響Table2 Effect of antagonism bacterium on physiological index in leaves of tobacco

表2顯示，接種DZQ3的煙草各項生理指標(biāo)要好于對照，其中在移栽后60 d時，即旺長期時差異最為顯著，此時處理煙株葉片的葉綠素含量、SOD、PPO、POD、PAL、CAT活性分別比對照高出17.03%、12.26%、17.49%、30.14%、20.65%和 43.78%，差異均達(dá)到顯著水平；移栽30 d時，電解質(zhì)相對滲透率、SOD、PPO、PAL活性與對照間差異顯著，電解質(zhì)相對滲透率低于對照26.35%，SOD、PPO、PAL活性分別比對照高出13.58%、25.13%和38.97%；移栽90 d時，只有SOD活性與對照間差異顯著，高出對照21.03%?？梢?，DZQ3對煙株系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)主要體現(xiàn)在團(tuán)稞期和旺長期等中前期生長階段，煙草葉片防御酶活性相比于對照有較大提升，增強(qiáng)了植株對病害的防御力，而在煙草生長后期差距不是很明顯，只有 SOD活性與對照間的差距在整個生長期內(nèi)均可達(dá)到顯著水平。

2.3 煙草根系發(fā)育

表3可見，DZQ3能夠促進(jìn)煙草的根系發(fā)育，煙株根系活力和根部鮮重分別比對照高出 38.34%和44.91%，差異顯著，根冠比略高于對照，但差異不顯著。

表3 煙草根系發(fā)育情況Table3 Root position of tobacco

2.4 煙草病害情況

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，試驗過程中DZQ3處理煙株和對照都不同程度的感染煙草花葉病，但是接種DZQ3的煙株發(fā)病較晚，且發(fā)病率低于對照。移栽35 d后，對照煙株開始出現(xiàn)花葉病癥狀，發(fā)病率為6.67%，49 d時發(fā)病率升至20%，56 d時達(dá)到33.30%；DZQ3處理煙株56 d時發(fā)現(xiàn)感染花葉病，發(fā)病率為6.67%，推遲發(fā)病21 d，同時期發(fā)病率低于對照26.63%。

3 討 論

短短芽孢桿菌作為植物根際普遍存在的細(xì)菌種屬，其促生作用已經(jīng)有所報道，例如A57能夠促進(jìn)棉花子葉的展開和幼苗的發(fā)育[18]，DS-1可以提高黃瓜種子的發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長，并且能夠誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[19]。本試驗結(jié)果表明，根際接種短短芽孢桿菌 DZQ3能夠有效的促進(jìn)煙草的生長，煙草農(nóng)藝性狀和生物量均好于對照。尤其是在煙草生長早期，DZQ3對煙株莖圍和葉面積的影響較大，有利于煙草在生長早期吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)、增強(qiáng)葉片的光合作用，為其生長發(fā)育打下良好的基礎(chǔ)。對煙草根系發(fā)育情況的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，DZQ3能夠促進(jìn)煙草的根部生長發(fā)育，煙株根系活力和根部鮮質(zhì)量顯著優(yōu)于對照，這對地上部分的生長和煙草的抗病性起到重要作用。

研究表明，生物因子和非生物因子等多種誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[20-21]。各種誘導(dǎo)因子可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)SOD、POD、CAT、PAL、PPO等防御酶活性的升高以及葉綠素、電解質(zhì)相對滲透率等生理指標(biāo)的改變。其中SOD、POD和CAT與植物體內(nèi)活性氧的清除密切相關(guān)[22]，PAL和 PPO與植物體內(nèi)酚類代謝和木質(zhì)素的形成有關(guān)，是與系統(tǒng)抗性密切相關(guān)的酶[23]，葉綠素含量是衡量植物光合作用能力的大小重要指標(biāo)，植物受到逆境脅迫時葉綠素含量會有所下降，電解質(zhì)相對滲透率則反映了植物對病原菌抵抗力的強(qiáng)弱，細(xì)胞電解質(zhì)滲透率小則不易受到病原菌的侵害。Liang等[22]通過分根法在黃瓜根部分別接種生防菌L8和猝倒病病原菌發(fā)現(xiàn)黃瓜根部和葉片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL活性均顯著升高，降低了黃瓜幼苗猝倒病的發(fā)病率；Vanitha等[24]研究發(fā)現(xiàn)番茄根際接種熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）增強(qiáng)了番茄對青枯病的抗性，PPO、PAL等防御酶活性顯著提升，且通過RT-PCR手段發(fā)現(xiàn)相關(guān)酶合成基因的表達(dá)水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)煙草根際接種DZQ3后，葉片中幾種防御酶活性和葉綠素含量均顯著高于對照，電解質(zhì)相對滲透率比對照有所降低，移栽60 d時各項指標(biāo)與對照間差異最為顯著，此時也是煙草田間病害的高發(fā)期，同時溫室試驗中發(fā)現(xiàn)接種DZQ3的煙草花葉病發(fā)病率比對照有所降低，可能是DZQ3誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性從而抵御花葉病毒侵害的原因。以上結(jié)果表明生防細(xì)菌DZQ3可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)煙草對病害的抵抗力。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，PGPR菌株短短芽孢桿菌DZQ3能有效改善煙草生長期內(nèi)的農(nóng)藝性狀、提高生物量，促進(jìn)葉片防御酶活性的升高及根系發(fā)育水平。因此具有良好的促生作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性能力，可以增強(qiáng)煙草植株對病害的防御力，有利于煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。短短芽孢桿菌是土壤中自然存在的細(xì)菌，對人體、動物無致病性，因而具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，但是關(guān)于DZQ3的促生機(jī)理、定殖能力和田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步的研究證明。

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