孫秀萍，宋晗星，蘇高莉，周 平，何 葉，王 麗，潘 偉，丁 寧，包英夫，孫 晨，宋德光

(1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021)

水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)屬于彈狀病毒科水泡病毒屬的成員，為具有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。水泡性口炎是由VSV引起的一種高度接觸性傳染病，主要以在感染動物的口腔、舌、唇、乳頭和蹄冠部上皮等部位皮膚/黏膜發(fā)生水泡為特征[1]。VSV以節(jié)肢動物為傳播媒介，可以感染嚙齒類動物及牛、豬、馬等多種動物[2]。人也可以偶爾感染VSV，引起類似急性流感樣的癥狀[3]。其臨床癥狀與口蹄疫(FMD)、豬水泡病(SVD)等極為相似，在獸醫(yī)臨床上容易被誤診。近年來，該病也有在我國自然發(fā)生的報道[4]，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，常見的VSV檢測方法主要有病毒分離鑒定、血清中和試驗(yàn)[5]、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和RT-PCR[6-7]等方法，但這些檢測方法大多成本較高，并且需要一些特殊儀器設(shè)備，不適合基層現(xiàn)場檢驗(yàn)工作的需要。因此，研制一種操作簡單、使用方便快捷的VSV檢測方法對于現(xiàn)地應(yīng)用十分必要。本研究在前期VSV單克隆抗體(MAb)制備的基礎(chǔ)上，采用純化的抗原制備了兔抗VSV多克隆抗體，通過對捕獲抗體和檢測抗體的篩選，建立了一種簡便、快速、特異的VSV雙抗體夾心ELISA檢測方法，為VSV的血清學(xué)快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障。

1 材料和方法

1.1 病毒與細(xì)胞株 水泡性口炎病毒(VSV-IND)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬水皰疹病毒(VESV)、羊傳染性膿皰病毒(ORFV/JL/08/CC)、BHK-21細(xì)胞、VSV MAb雜交瘤細(xì)胞株1A2(識別VSV結(jié)構(gòu)蛋白的G蛋白)由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(HRP-IgG)和羊抗兔HRP-IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購自天根生化科技(北京)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司。

1.3 病毒的純化 將VSV接種于BHK-21單層細(xì)胞，細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%以上時收獲病毒，反復(fù)凍融3次后，3000 r/min離心30 min，除去細(xì)胞碎片；再經(jīng)5000 r/min離心30 min，取上清以30000 r/min 4℃離心3 h，棄上清，將沉淀用少量PBS充分懸浮，獲得粗提病毒，測其濃度及毒力并分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MAb的制備及純化 將本實(shí)驗(yàn)室保存的VSV MAb雜交瘤細(xì)胞株1A2按常規(guī)方法復(fù)蘇后制備小鼠腹水；采用辛酸－飽和硫酸銨法對制備的腹水進(jìn)行純化；并用已建立的間接ELISA方法對其進(jìn)行抗體效價檢測；用紫外分光光度計(jì)測量蛋白濃度。

1.5 兔抗VSV多克隆抗體的制備及純化 將純化的病毒稀釋至1.5 mg/mL，58℃30 min滅活后與等量的弗氏完全佐劑乳化，背部皮下多點(diǎn)注射清潔級大耳白兔，每只注射1 mL；兩周后用VSV加弗氏不完全佐劑皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫兩次，劑量與初次免疫相同，每次間隔兩周；最后一次免疫后第15 d，兔頸動脈放血分離血清，采用辛酸－飽和硫酸銨法對其純化，用間接ELISA方法檢測其抗體效價，同時用紫外分光光度計(jì)測其濃度。

1.6 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

1.6.1 雙抗體夾心ELISA基本試驗(yàn)步驟 以純化的MAb包被酶標(biāo)板，4℃過夜，PBST洗板3次，每次5 min；37℃封閉90 min，洗板；加入待檢樣品，37℃反應(yīng)1 h，洗板；加入第二抗體，37℃反應(yīng)1 h，洗板；加羊抗兔HRP-IgG，37℃反應(yīng)45 min，洗板；加入TMB顯色液，37℃避光顯色；加入終止液，終止反應(yīng)；測定OD450nm值并觀察和判讀結(jié)果。

1.6.2 捕獲抗體和檢測抗體的確定 分別以MAb 1A2為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，以兔抗VSV的多克隆抗體為檢測抗體建立雙抗體夾心ELISA方法；以兔抗VSV多克隆抗體為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，以MAb 1A2為檢測抗體建立雙抗體夾心ELISA方法。

1.6.3 捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度的確定采用方陣滴定法確定捕獲抗體和檢測抗體的最佳工作濃度。將捕獲抗體做1∶100倍比稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，檢測VSV標(biāo)準(zhǔn)株；將檢測抗體做1∶100倍比稀釋后加到酶標(biāo)板中進(jìn)行檢測。

1.6.4 雙抗體夾心ELISA檢測條件的優(yōu)化

1.6.4.1 最佳包被條件的確定：用0.05 mol/L碳酸鹽稀釋包被抗體，包被時間分別為37℃2 h、4℃12 h、4℃12 h并37℃ 2 h，在相同條件下，進(jìn)行雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)，確定最佳包被條件。

1.6.4.2 抗原最佳作用時間的確定：在鼠MAb和兔多抗最佳稀釋倍數(shù)及最佳包被時間的條件下，加入VSV，于37℃分別反應(yīng)30 min、60 min和90 min進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定抗原的最佳作用時間。

1.6.4.3 封閉液及封閉時間的確定：在相同的試驗(yàn)條件下，分別用2%BSA、3%BSA、5%BSA、5%脫脂奶粉、5%山羊血清作封閉液進(jìn)行上述ELISA試驗(yàn)，確定最佳封閉液；之后在確定的最佳封閉液的條件下，分別37℃封閉1 h、1.5 h、2 h及4℃封閉12 h進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定最佳封閉時間。

1.6.4.4 酶標(biāo)抗體工作濃度及反應(yīng)時間的確定：在上述確定的最佳試驗(yàn)條件下，酶標(biāo)抗體按1∶1000～1∶6000稀釋進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度，在確定的最佳酶標(biāo)抗體濃度的基礎(chǔ)上，酶標(biāo)抗體分別反應(yīng)30 min～120 min進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定酶標(biāo)抗體的最佳作用時間。

1.6.5 ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 采用建立的ELISA方法檢測30份VSV陰性樣品，測定OD450nm值，計(jì)算OD450nm的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以樣品的OD450nm值X+3SD和X+2SD作為陽性與陰性的臨界值。

1.7 雙抗體夾心ELISA的性能評價

1.7.1 特異性試驗(yàn) 采用建立的夾心ELISA方法對VSV、SVDV、VESV和ORFV進(jìn)行檢測，評價該方法的特異性；將VSV細(xì)胞培養(yǎng)物分別與兔抗VSV陽性血清和陰性血清混合，37℃孵育1 h后，用建立的夾心ELISA方法對其進(jìn)行檢測，重復(fù)5次，根據(jù)阻斷前后樣品測得的OD450nm值評價該方法的阻斷效果。

1.7.2 靈敏性試驗(yàn) 將純化的VSV用PBS稀釋至400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL和1.5625 μg/mL，用建立的夾心ELISA方法對其檢測，以抗原稀釋濃度做橫坐標(biāo)，讀取的OD450nm值做縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該方法的靈敏度。

1.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 采取同一批次(n=5)和不同批次(n=5)酶標(biāo)板，分別檢測5份陽性樣品和5份陰性樣品，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)，以評估該夾心ELISA方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣品的檢測 從吉林省及遼寧省部分地區(qū)采集187份疑似水VSV感染的臨床病料的水泡液，分別用無菌PBS按1∶10稀釋，用本實(shí)驗(yàn)建立的夾心ELISA和RT-PCR[7]進(jìn)行平行檢測，評價ELISA相對RT-PCR的特異性、敏感性及符合率。

2 結(jié)果

2.1 病毒的純化 將細(xì)胞培養(yǎng)的VSV用差速離心及超速離心純化后，紫外分光光度計(jì)測其蛋白濃度為3.08 mg/mL。VSV接種MDBK細(xì)胞的感染滴度為10-5/0.1 mL。

2.2 MAb和多抗的制備及純化 用已建立的間接ELISA方法對純化的MAb及多抗進(jìn)行抗體效價檢測，其效價分別為2.56×104和1.28×104；用紫外分光光度計(jì)測得純化后的MAb及兔抗VSV多抗的濃度分別為4.938 mg/mL和4.125 mg/mL。

2.3 雙抗體夾心ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 在建立VSV雙抗體夾心ELISA檢測方法時，本實(shí)驗(yàn)對捕獲抗體和檢測抗體的選擇及其最佳工作濃度、最佳包被條件、抗原最佳作用時間、最佳封閉液及封閉時間、酶標(biāo)抗體工作濃度及反應(yīng)時間等各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表1所示，以MAb 1A2為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，以兔抗VSV的多克隆抗體為檢測抗體；通過方陣滴定法確定MAb 1A2 的最佳包被濃度為 1∶1600(3.09 μg/mL)，兔抗VSV 的最佳工作濃度為 1∶800(5.16 μg/mL)；最佳包被時間確定4℃12 h；37℃60 min為抗原最佳作用條件；用5%BSA作為封閉液，其P/N值較高，封閉效果比較理想；37℃1.5 h封閉時間最優(yōu)；酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1∶5000，其最佳反應(yīng)時間為45 min。

表1 雙抗體夾心ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the sandwich ELISA

2.4 ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 用建立的雙抗體夾心ELISA法檢測30份VSV陰性樣品，以測定OD450nm值為橫坐標(biāo)，以各組(分7組)頻數(shù)為縱坐標(biāo)，得到陰性樣品的分布直方圖(圖1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，樣品的()和SD分別為0.135和0.032，根據(jù)公式+3SD計(jì)算，陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的臨界值為0.231，即OD450nm值>0.231判為陽性；根據(jù)公式+2SD計(jì)算，陰性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的臨界值為0.199，即OD450nm值<0.199判為陰性；OD450nm值在0.199～0.231之間的判為可疑樣品。

圖1 陰性樣品分布圖Fig.1 Distribution of negative sample

2.5 特異性試驗(yàn) 用建立的ELISA方法分別檢測VSV、SVDV、VESV和ORFV，該方法僅在檢測VSV時OD450nm值>0.231(圖2)，表明該方法在檢測其它相關(guān)病毒時不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性良好；VSV陽性樣品能夠被兔抗VSV陽性血清阻斷，而不被兔抗VSV陰性血清阻斷(表2)。

圖2 雙抗體夾心ELISA交叉反應(yīng)結(jié)果Fig.2 Cross-reaction tests of DAS-ELISA

表2 雙抗體夾心ELISA阻斷試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The block assay of DAS-ELISA

2.6 靈敏性試驗(yàn) 用該方法對不同濃度的VSV進(jìn)行檢測，以抗原稀釋濃度做橫坐標(biāo)，讀取的OD450nm值做縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，其線性良好，線性回歸方程為Y=4.9273X+0.1962，線性回歸常數(shù)R2為 0.9965，檢測范圍為 3.125 μg/mL～400 μg/mL，該方法最低可以檢測3.125 μg/mL(101TCID50)的病毒。

圖3 雙抗體夾心ELISA靈敏性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity tests of DAS-ELISA

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)及批間檢測樣品的重復(fù)性結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為2.04%～8.17%，批間變異系數(shù)為3.26%～9.21%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)勻小于10%，表明此方法具有較好的重復(fù)性(表3)。

表3 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of intra-batch and inter-batch reproducibility tests

2.8 臨床樣品的檢測 采用建立的夾心ELISA方法和RT-PCR同時檢測187份臨床樣品(表4)，ELISA檢測16份陽性，171份陰性；RT-PCR檢測18份陽性，169份陰性。兩種方法檢測均為陽性的為15份，均為陰性的為168份。經(jīng)計(jì)算得出夾心ELISA較PCR的特異性和敏感性分別為99.4%(168/169)和83.3%(15/18)，兩者的符合率為97.9%[(15+168)/187]，提示該方法可以代替RT-PCR用于VSV臨床樣本檢測。

3 討論

雙抗體夾心ELISA方法已被大量用于動物疫病的臨床診斷，該方法中捕獲抗體和檢測抗體的選擇是影響其特異性的關(guān)鍵因素[8-9]。本實(shí)驗(yàn)在選擇時，以抗VSV-G MAb 1A2作為捕獲抗體，兔多抗作為檢測抗體建立雙抗體夾心ELISA，這可能與MAb的特異性強(qiáng)有關(guān)，其加強(qiáng)了抗原抗體反應(yīng)的特異性，使檢測反應(yīng)具有較高的靈敏度和特異性。而用兔抗VSV包被酶標(biāo)板，以抗VSV-G MAb作為檢測抗體建立的雙抗體夾心ELISA，測得的OD450nm值始終偏低(小于0.25)，原因可能是多抗作為捕獲抗體結(jié)合了大部分的抗原決定簇，從而減少了抗原與MAb結(jié)合的表位，導(dǎo)致抗原與檢測抗體結(jié)合的效率降低，在一定程度上降低了檢測方法的敏感性[10]。

表4 ELISA和RT-PCR對臨床樣品檢測結(jié)果的比較Table 4 Comparison of detection results of clinical samples between ELISA and RT-PCR

抗體的效價和純度是影響雙抗體夾心ELISA敏感性的關(guān)鍵因素，因此本實(shí)驗(yàn)采用純化的全病毒免疫動物，以獲得抗VSV所有結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，并且對抗VSV MAb和兔源的多抗采用辛酸－飽和硫酸銨法進(jìn)行了純化，同時進(jìn)行了抗體間的交叉反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果表明背景值低，以最大可能降低了非特異性反應(yīng)，從而提高了敏感性。

本實(shí)驗(yàn)通過方陣滴定法確定了抗VSV MAb、兔抗VSV高免血清的最佳工作濃度并對該方法中孵育溫度、反應(yīng)時間、封閉液、酶標(biāo)抗體的濃度等進(jìn)行了優(yōu)化，用于檢測VSV抗原，靈敏度達(dá)3.125 μg/mL(101TCID50)；與SVDV、VESV和ORFV不發(fā)生交叉反應(yīng)，并結(jié)合阻斷試驗(yàn)，特異性良好。此外，本研究通過臨床樣本的檢測及與RT-PCR的試驗(yàn)比較，兩者的符合率為97.9%，表明在臨床應(yīng)用方面該方法可以代替RT-PCR用于VSV的快速檢測。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的檢測VSV的雙抗體夾心ELISA方法較常見的VSV檢測方法，如病毒分離鑒定、RT-PCR，成本低廉、操作簡便、設(shè)備簡單、快速穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適合基層現(xiàn)場檢驗(yàn)工作的需要，可以為VSV的臨床快速檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供有效的工具，也為動物性食品檢疫等公共衛(wèi)生安全提供了有力的保障。

[1]Comer J A,Tesh R B,Govine B M,et al.Vesicular stomatitis virus,New Jersey serotype:replication in and transmission by Lutzomyia shannoi[J].Am J Trop Med Hyg,1990,42(5):483-490.

[2]Mead D G,Ramberg F B,Besselsen D G,et al.Transmission of vesicular stomatitis virus from infected to noninfected black flies co-feeding on nonviremic deer mice[J].Science,2000,287:485-487.

[3]Schmitt B.Vesicular stomatitis[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract,2002,18(3):453-459.

[4]馬俊儒，馬相齋.牛暴發(fā)水泡性口炎[J].畜牧與獸醫(yī)，2003，35(1)：44.

[5]Alvarado J F,Dolz G,Herrero M V.Comparison of the serum neutralization test and a competitive ELISA assay for the detection of antibodies to VSV-NJ and VSV-IN[J].J Vet Diagn Invest,2002,14:240-242.

[6]Rodriquez L L,Letchworth G J,Spiropoulou C F,et al.Rapid detection of vesicular stomatitis virus New Jersey serotype in clinical samples by using polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol,1993,31:2016-2020.

[7]楊桂梅，徐自忠.VSV的RT-PCR快速檢測方法的建立[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2003，20(2)：23-27.

[8]Hut chings G H,Ferris N P.Indirect sandwich ELISA for antigen detection of African swine fever virus:comparison of polyclonal and monoclonal antibodies[J].J Virol Methods,2006,131(2):213-217.

[9]Panadero R,Vazquez L,Colwell D D,et al.Evaluation of an antigen capture ELISA for the early diagnosis of H ypodermalineatum in cattle under field conditions[J].Vet Parasitol,2007,147(3/4):297-302.

[10]楊俊興，花群義，陳煥春，等.檢測藍(lán)舌病病毒雙抗夾心ELISA方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2009，39(1)：50-53.