李建軍 宋曙霞 陳克芳 潘愛(ài)珍 黃啟輝 梁俊雄 易偉民

血瘀證是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的主要證型。證是遺傳和環(huán)境因素相互作用的病理表現(xiàn)，證與遺傳變異間的關(guān)系研究甚少，NO與血管緊張素II(AngII)生理作用相反，在血瘀證形成中有重要作用。本文就冠心病血瘀證與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因多態(tài)性和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因G894T變異的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料

從2010年6月至2011年3月，在廣州中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院共診治廣東籍漢族冠心病患者160例，經(jīng)中醫(yī)辨證分為血瘀證和非血瘀證，其中血瘀證組119例，其中男62例，女57例，平均年齡(64.4±10.62)歲。非血瘀證組41例，其中男21例，女20例，平均年齡(59.5±15.52)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

冠心病診斷參照1979年WHO制定的缺血性心肌病“心絞痛”、“心肌梗死”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，以患者臨床癥狀，體征和病史結(jié)合心電圖改變進(jìn)行診斷，全部病例均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影。血瘀證診斷根據(jù)1986年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì)制定的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影診斷，符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)符合中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)有嚴(yán)重心、腎、肝、肺功能不全者；(2)半年內(nèi)有外傷和外科手術(shù)史者；(3)合并惡性腫瘤者。

1.5 DNA提取

抽取患者2 ml靜脈血，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)抗凝，參照TaKara Company DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。

1.6 ACE基因型檢測(cè)

上游引物序列5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’，下游引物序列5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’。引物均由達(dá)安基因公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘→94℃變性30秒→62℃復(fù)性30秒→72℃延伸1分鐘，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘結(jié)束。取4 ul PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定分型，ACE基因上若存在Alu序列，PCR產(chǎn)物位490 bp，即為插入型(I型)；沒(méi)有Alu序列，PCR產(chǎn)物為190 bp,為缺失型(D)型，兩者都有則為(I/D)型。因此ACE基因型可分為II、I/D、DD三種基因型。

1.7 eNOS基因變異檢測(cè)

上游引物序列5’-CATGAGGCTCAGCCCCAGAAC-3’，下游引物序列5’-AGTCAATCCCTTTGGTGCTCAC-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘→94℃變性30秒→60℃復(fù)性30秒→72℃延伸1分鐘，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘結(jié)束。取4 ul PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定分型，eNOS上若不存在變異，則PCR產(chǎn)物為206 bp，即為GG型，若存在變異序列，PCR產(chǎn)物即為119 bp，87 bp兩條帶即為TT型，若為GT型則產(chǎn)物出現(xiàn)206 bp,119 bp，87 bp三條帶。所有eNOS基因型可分為GG、GT、TT三種基因型。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 冠心病血瘀證組與非血瘀證組ACE基因型分布情況

160例冠心病血瘀證與非血瘀證ACE基因D等位基因及I等位基因分布頻率比較χ2= 0.117，P>0.05，兩組間無(wú)差異，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。 冠心病血瘀證和非血瘀證組ACE基因型比較χ2=0.009，P>0.05，兩組間無(wú)差異。見(jiàn)表1。

2.2 血瘀證組與非血瘀證組eNOS基因型比較

冠心病血瘀證與非血瘀證ACE基因G等位基因、T等位基因分布頻率比較χ2=0.427，P>0.05，兩組間無(wú)差異，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。冠心病血瘀證和非血瘀證組eNOS基因型比較χ2=0.78，P>0.05兩組間無(wú)差異。見(jiàn)表2。

2.3 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因型分布比較

比較冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因DD、I/D、II型分布，血瘀證組DD、I/D型基因患者血管狹窄支數(shù)較II型多。選用精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2=12.96，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.4 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與的eNOS基因型分布比較

選用精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2=8.08，P>0.05，表明冠心病血瘀證各兼證血管狹窄支數(shù)與eNOS基因GG、GT、TT型分布無(wú)差異。見(jiàn)表4。

2.5 冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因型分布比較

經(jīng)精確概率法分析，χ2=13.826，P<0.05，冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因DD、I/D、II型分布差異明顯。隨著支架數(shù)的增多，II基因型分布減少。見(jiàn)表5。

2.6 冠心病血瘀證支架數(shù)與eNOS基因型分布

選用精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2=3.9，P>0.05，冠心病血瘀證血管狹窄支數(shù)與eNOS基因GG、GT、TT型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表6。

表1 冠心病血瘀證組與非血瘀證組ACE基因型分布

表2 冠心病血瘀證與非血瘀證組eNOS基因型比較

表3 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因型分布比較

表4 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與的eNOS基因型分布比較

表5 冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因型分布比較

表6 冠心病血瘀證支架數(shù)與eNOS基因型分布比較

3 討論

冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹、心痛”范疇?！端貑?wèn)·脈要精微論》云：“脈者……血之府也……澀則心痛，”強(qiáng)調(diào)胸痹心痛病位在心，病機(jī)關(guān)鍵在于血脈瘀阻。古今大量以活血化瘀藥為主組成的治療胸痹心痛的有效方劑，在臨床實(shí)踐中也證明了心血瘀阻是胸痹心痛的最主要病理改變。因此，血瘀證是目前研究冠心病證型的熱點(diǎn)。而冠心病血瘀證的現(xiàn)代研究多集中在血液流變學(xué)、凝血功能、血管內(nèi)皮功能損傷、炎性介質(zhì)等諸方面[3-5]，但與遺傳因素的關(guān)系研究甚少。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，冠心病是多基因遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。流行病學(xué)已證實(shí)：冠心病是一種遺傳疾病。目前發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性影響脂質(zhì)代謝、血栓形成、血管舒張、收縮等病理生理過(guò)程，與冠心病發(fā)生的危險(xiǎn)性增加具有密切相關(guān)性，其中以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性，內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T變異的相關(guān)性研究較為深入。但結(jié)果不一。

ACE主要作用是催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，后者具有收縮血管、促進(jìn)平滑肌增殖、促進(jìn)血小板粘附和聚集等生理功能；ACE活性受基因調(diào)控，人類ACE基因的第16個(gè)內(nèi)含子中存在287 bp的Alu重復(fù)序列，具有插入/缺失多態(tài)性,含有此片段的稱為“I”(Inserxion)，不含此片段的稱為“D”(Deletion)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DD型者血清ACE水平比II型者高出2倍，I/D型者ACE水平介于DD型及II型中間[6]。NaKai[7]的研究表明，ACE基因缺失型多態(tài)性不僅與血清ACE水平相關(guān)，并增加冠心病的危險(xiǎn)性。云美玲等[8]比較海南漢族150例冠心病患者和150 例漢族正常人ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性檢測(cè)觀察DD，DI，II基因型頻率及等位基因頻率，認(rèn)為ACE基因I/D多態(tài)性與漢族冠心病有顯著關(guān)聯(lián)，是漢族冠心病的致病的主要基因，ACE缺失多態(tài)性是漢族冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但是，楊忠偉等[9]對(duì)新疆地區(qū)的類似研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因多態(tài)性與新疆地區(qū)漢族冠心病關(guān)聯(lián)性不大。

eNOS是心血管系統(tǒng)合成一氧化氮(NO)的主要酶，NO具有擴(kuò)張血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板粘附和聚集等生理功能[10]。eNOS基因編碼序列第894位堿基發(fā)生G突變?yōu)門(G894T)變異，可能與冠心病發(fā)病相關(guān)。Cuilin Zhang等[11]通過(guò)對(duì)861名糖尿病患者NOS基因G894T基因進(jìn)行分析,其中220名患有冠心病患者為實(shí)驗(yàn)組，641名沒(méi)有冠心病的患者為對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eNOS基因與冠心病的發(fā)生不具有相關(guān)性，并不會(huì)增加該病的危險(xiǎn)性。彭瑾瑜等[12]對(duì)103例冠心病患者、104 例對(duì)照組eNOS基因G894T多態(tài)性的基因型，分析了它對(duì)冠心病的影響顯示：冠心病組和對(duì)照組eNOS基因G894T多態(tài)性的等位基因頻率差異相顯著(P=0.029)，認(rèn)為冠心病組的eNOS基因G894T突變頻率比對(duì)照組高，T 等位基因可能與冠心病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。但李敏等[13]通過(guò)Meta分析得出結(jié)論：eNOS基因G894T多態(tài)性的TT基因型會(huì)增加冠心病的發(fā)病危險(xiǎn),認(rèn)為它可能是冠心病的遺傳危險(xiǎn)因素之一。

冠心病血瘀證與ACE基因的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)的結(jié)果不甚一致。毛以林等[14]用PCR法檢測(cè)48例血瘀證和52例非血瘀證冠心病患者及54名健康人的ACE基因型，結(jié)果顯示冠心病血瘀證組ACE基因DD型及D等位基因頻率比非血瘀證組和健康對(duì)照組高(P<0.01)；DD型ACE基因可能為冠心病血瘀證發(fā)病的易感基因。黃獻(xiàn)平等[15]的研究也表明ACE基因DD型和D等位基因的頻率增高可能是冠心病心血瘀阻證易感基因型；認(rèn)為可能與D等位基因?qū)е翧ngⅡ異常增多有關(guān)。但是李杰等[16]在冠心病血瘀證家系中未發(fā)現(xiàn)ACE基因I/D多態(tài)性與冠心病血瘀證存在明顯的相關(guān)性，認(rèn)為該基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易患基因，只是冠心病血瘀證的發(fā)病危險(xiǎn)因素之一。國(guó)內(nèi)對(duì)冠心病血瘀證與eNOS基因的相關(guān)性研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究表明，冠心病血瘀證與非血瘀證ACE基因多態(tài)性、eNOS基因變異分布頻率無(wú)顯著差異，提示冠心病血瘀證與ACE基因和eNOS基因變異無(wú)明確相關(guān)性，說(shuō)明ACE基因多態(tài)性和eNOS基因變異不是冠心病血瘀證的主要遺傳因素。但在比較血瘀證組和非血瘀證組血管狹窄支數(shù)及PCA支架數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)ACE基因DD、I/D型較II型增多，間接提示血瘀證嚴(yán)重程度可能與ACE基因DD、I/D變異相關(guān)，當(dāng)冠心病血瘀證有ACE基因DD、I/D變異時(shí)，可能存在冠狀動(dòng)脈多支病變，病情嚴(yán)重，與王階等[17]的研究相一致。本研究的結(jié)果還提示，冠心病血瘀證存在復(fù)雜的遺傳背景，在今后的工作中需應(yīng)用基因組學(xué)、芯片技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Nomenclature and criteria for diagnosis of ischemic heart disease. Report of the Joint International Society and Federation of Cardiology/World Health Organization task force on standardization of clinical nomenclature[J].Circul,1979,59(3):607-609.

[2] 血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1987,7(3):129.

[3] 廖奕華.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病血瘀證患者免疫功能的初步研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，1998,25(2)：58.

[4] 洪永敦,黃衍壽,吳輝,等.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病中醫(yī)證候與炎癥因子關(guān)系的臨床研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,22(2):81-85.

[5] 李越華,肖滬生.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病中醫(yī)辯證分型與心功能及血液流變學(xué)之間關(guān)系的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2004,31(12):998-999.

[6] Harrap SB,Tourio C, Cambien F,et al.The ACE gene I/D polymorphism is not associated with the blood pressure and carsiovoscular beniefits of ACE inhibition[J].Hypertention,2003,42(3):297-303.

[7] Nakai K, Itoh C, Miura Y,et al.Deletion polymorphism Of the angiotendsin I converting enzyme genen is associated with serum ACE concentration and increased risk for CAD in the Japanese[J].Circulation,1994,20(5):2199-2202.

[8] 云美玲，鐘江華，鄭茵,等.海南漢族冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的相關(guān)性[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9(4)：625-627.

[9] 楊忠偉，馮秀麗，梁曉安，等.新疆地區(qū)漢族血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病相關(guān)性研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，11(29)：2718-2719.

[10] 農(nóng)一兵,林謙,王薇,等.急性心肌梗死中醫(yī)辨證論治現(xiàn)狀的研究——基于北京288例患者的橫斷面調(diào)查[J].北京中醫(yī),2007,26(7):387-388.

[11] Cuilin Zhang, Ruy Lopez-Ridaura,David J, et al. Common Variants of the Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene and the Risk of Coronary Heart Disease Among U.S. Diabetic Men[J].DIABETES,2006,7(55):2140-2146.

[12] 彭瑾瑜，彭懷燕，聶新民,等.漢族人內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病關(guān)系的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009，34(1):20-23.

[13] 李敏,賈崇奇．內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與冠心病關(guān)系的Meta分析[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2006，14(10)：899-902.

[14] 毛以林,袁肇凱,黃獻(xiàn)平,等.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病血淤證與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(9):776.

[15] Radosmki MW, Palmer RM, Moncada S. Endogenous nitric oxide inhibits human platelet adhesion to vascular endothelium[J].Lancet,1987,2(8567):1057-1058.

[16] 李杰,袁肇凱,黃獻(xiàn)平,等.湖南漢族人群ACEI/D基因多態(tài)性與冠心病血瘀證的遺傳流行病學(xué)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2007，5(9)：787-789

[17] 王階,何慶勇,馬長(zhǎng)生,等.基于冠脈造影的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病冠脈病變與血瘀證的相關(guān)性研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,28(12):1074-1077.