金泉克 許建華 肖海娟 陸海 余文燕 王國(guó)娟 孫玨 范忠澤

大腸癌是世界各國(guó)惡性腫瘤中的主要死亡原因之一，在中國(guó)，大腸癌的死亡率位居癌癥死亡率的第4、5位[1]，而發(fā)達(dá)地區(qū)其死亡率已上升到各種惡性腫瘤中的第3位，上海則已居第二位[2]。奧沙利鉑是目前結(jié)腸癌的一線化療用藥,雖然奧沙利鉑對(duì)許多耐順鉑或卡鉑的腫瘤細(xì)胞仍抑制作用，并且在抗癌活性及毒副反應(yīng)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，但奧沙利鉑耐藥問(wèn)題也成為影響臨床療效的一大難題[3]。筆者的前期研究表明，具有健脾化濕解毒功效的上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑腸胃清方可明顯提高晚期胃腸道腫瘤患者以鉑類為基礎(chǔ)的化療的療效，明顯改善生存質(zhì)量，延長(zhǎng)中位生存期[4,5]。應(yīng)用筆者所在的課題組建立的奧結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT 116/L-OHP及其親本株HCT 116進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)研究表明，腸胃清藥物血清可通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)途徑，提高奧沙利鉑抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果[6]。本研究在上述工作的基礎(chǔ)上，建立HCT 116及HCT 116/L-OHP結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，進(jìn)一步觀察中藥復(fù)方腸胃清煎劑對(duì)L-OHP抑瘤的增效作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT 116，購(gòu)于南京凱基生物公司。HCT 116/L-OHP為本實(shí)驗(yàn)室自行誘導(dǎo)，對(duì)L-OHP耐藥倍數(shù)達(dá)17.00倍。BALB/c裸小鼠80只，4～6周齡，體重(20±2)g，雌雄各半。購(gòu)自于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK (滬) 2003-0002]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)為SYXK (滬) 2005-0008]，自由飲食。

1.2 主要試劑及儀器

CELL 240型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)賀利氏公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；101-2干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；95%乙醇(分析純)(上海振興化工廠)；奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；乙二醇雙乙胺醚-N，N’-四乙酸(EDTA)(Sigma公司)。

1.3 中藥制備

腸胃清煎劑：由生黃芪30 g、黨參15 g、生白術(shù)15 g、豬苓24 g、薏苡仁30 g、八月札24 g、野葡萄藤30 g、紅藤30 g組成。由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑室熬制成水煎劑，參照人與小鼠等效劑量換算公式，小鼠劑量約合25 g/kg，高劑量組為50 g/kg。煎煮方法：加水浸泡1小時(shí)，水煎2次，每次煎煮1.5小時(shí)，每次用水量為藥材的10倍量，水煎液過(guò)濾后濃縮至約150 ml，即為含生藥1.33 g/ml的水煎劑。

1.4 人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT 116/L-OHP的皮下移植瘤的建立

接種方法參考《細(xì)胞培養(yǎng)》[7]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT 116/L-OHP及HCT 116。將細(xì)胞消化后收集到離心管中，然后用磷酸緩沖液(PBS)制成濃度為1×107/ml的細(xì)胞懸液。取4～6周齡BALB/C裸鼠6只，體重(20±2)g，雌雄各半。常規(guī)消毒裸鼠右前肢的腋部皮下。按2×106個(gè)/0.2 ml的細(xì)胞數(shù)量，接種到裸小鼠的右前肢的腋部皮下，傳代14天后，自裸鼠身上剝離腫瘤組織，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)破潰的腫瘤組織置于生理鹽水中，切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊備用。在超凈臺(tái)中，裸鼠常規(guī)消毒，用20號(hào)套管針接種于裸小鼠背部右側(cè)近前肢皮下。本實(shí)驗(yàn)所用腫瘤細(xì)胞株為第4代，異位瘤傳至第3代為模型。

1.5 L-OHP劑量的確定

最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)指動(dòng)物能夠耐受的而不引起動(dòng)物死亡的最高劑量。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)本研究以裸小鼠對(duì)L-OHP 1/2 MTD為實(shí)驗(yàn)劑量。參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道，選擇健康裸小鼠15只，分設(shè)不同的劑量組(30、25、20、15、10 mg/kg)，每組3只動(dòng)物，每周腹腔注射L-OHP 3次(星期一、三、五)，連續(xù)3周，最后確定本研究的MTD，1/2 MTD作為實(shí)驗(yàn)劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅有10 mg/kg組裸鼠均存活，即本研究MTD量。故以5 mg/kg作為實(shí)驗(yàn)劑量。見(jiàn)表1。

表1 荷瘤裸鼠L-OHP劑量確定

1.6 動(dòng)物分組及藥物干預(yù)

參照《中藥新藥研制開(kāi)發(fā)技術(shù)與方法》[9]。造模成功后，待HCT 116及HCT 116/L-OPH腫瘤生長(zhǎng)至50～100 mm3左右，分別將50只裸鼠隨機(jī)分成5組，每組10只：對(duì)照組予以生理鹽水灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，并予以生理鹽水腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周；腸胃清組，以50 g/kg的腸胃清煎劑予以灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，并予以生理鹽水腹腔注射，同前，共3周；L-OPH組予以1/2 MTD L-OPH腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周，生理鹽水灌胃同前；腸胃清高、低劑量+L-OPH組，分別按50 g/kg和25 g/kg的腸胃清煎劑予以灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，予以L-OPH 1/2 MTD腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周。

1.7 腫瘤體積的測(cè)量

以腫瘤體積的變化，反映藥物的療效。從開(kāi)始給藥當(dāng)天即用卡尺測(cè)量腫瘤大小，每周2次，腫瘤體積以公式〔π/6(w1×w2×w2)〕計(jì)算(w1為瘤塊最大徑，w2為最小徑)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線。并以此計(jì)算T/C%(T代表實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積，C代表對(duì)照組腫瘤體積)[10]。

1.8 荷瘤小鼠的體重

以體重的減輕反映治療的毒副作用。體重每周測(cè)定3次，直至末次治療后2周。體重的減輕用公式：開(kāi)始體重-最輕體重/開(kāi)始體重×100%計(jì)算[11]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腸胃清煎劑聯(lián)合化療藥物對(duì)皮下移植瘤瘤體抑制率

瘤體生長(zhǎng)曲線表明，腸胃清煎劑及L-OHP均能在一定程度延緩皮下移植瘤的生長(zhǎng)，腸胃清聯(lián)合化療藥物可顯著減緩腫瘤的生長(zhǎng)，尤以腸胃清高劑量+L-OHP組瘤體生長(zhǎng)最為緩慢，見(jiàn)圖1、3。腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OHP組對(duì)荷HCT 116移植瘤小鼠抑瘤率分別為84.48%、56.66%、53.75%、48.32%，以腸胃清煎劑聯(lián)合L-OHP組明顯，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；對(duì)荷HCT 116/L-OHP移植瘤小鼠抑瘤率分別為74.87%、47.90%、43.52%、38.01%，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；見(jiàn)圖2、4。同時(shí)聯(lián)合給藥對(duì)耐藥株皮下異位瘤的抑制率較敏感株增加，其抑制效果明顯，在有效治療劑量中，與腸胃清劑量存在量效關(guān)系，見(jiàn)圖1-4。

2.2 腸胃清煎劑聯(lián)合化療藥物對(duì)皮下移植瘤荷瘤體重的影響

圖1 腸胃清煎劑對(duì)HCT 116/L-OHP細(xì)胞系皮下移植瘤瘤體生長(zhǎng)曲線

圖2 腸胃清煎劑對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞系皮下移植瘤抑瘤率

圖3 腸胃清煎劑對(duì)HCT116細(xì)胞系皮下移植瘤瘤體生長(zhǎng)曲線

圖4 腸胃清煎劑對(duì)HCT116細(xì)胞系皮下移植瘤抑瘤率

兩組移植瘤小鼠體重在治療后，敏感株異位瘤組：對(duì)照組體重減輕為2%，腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OPH組裸鼠體重減輕分別為5%、9.87%、7%、6.43%，同空白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表2；耐藥細(xì)胞株異位瘤組：對(duì)照組體重減輕為2.20%，腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OPH組裸鼠體重減輕分別為4.29%、8.77%、3.21%、3.97%，以L-OHP組最為顯著，同空白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，兩腸胃清煎劑聯(lián)合化療作用組荷瘤鼠體重減輕影響均少與化療組，同對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；同L-OHP組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 腸胃清煎劑對(duì)荷HCT116移植瘤小鼠體重變化

注：與對(duì)照組相比aP<0.05。

表3 腸胃清煎劑對(duì)荷HCT116/L-OHP移植瘤小鼠體重變化

注：與對(duì)照組相比aP<0.05，同L-OHP組比較bP<0.05。

3 討論

近年來(lái)中國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率逐漸升高，但臨床上腫瘤化療耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，影響了患者生存期的延長(zhǎng)和生活質(zhì)量的改善[12]。腫瘤的多藥耐藥性(MDR)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，影響因素和參與機(jī)制眾多，這也是造成化療失敗的重要原因[13]。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，中醫(yī)藥聯(lián)合化療可提高化療的效果，其增效作用不僅表現(xiàn)在非鉑類化療的個(gè)體中，而且在以鉑類為基礎(chǔ)治療方案的肺癌、卵巢癌等腫瘤中也得到充分體現(xiàn)[14,15]。體內(nèi)的增效作用，與增加腫瘤化療的敏感性密切相關(guān)，同時(shí)與減少腫瘤血管的生成、抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能等關(guān)聯(lián)。

大腸癌在中醫(yī)學(xué)中屬“積聚”、“腸風(fēng)”、“下痢”、“臟毒”等范疇，其發(fā)病普遍認(rèn)為涉及二方面因素：一為內(nèi)因，為正氣不足；一是外因，為毒邪損傷腸絡(luò)，痰瘀凝聚腸道所致。腸胃清方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院博士生導(dǎo)師范忠澤教授的經(jīng)驗(yàn)方，主要由生黃芪、白術(shù)、豬苓、米仁、八月札、野葡萄藤等組成，具有益氣補(bǔ)脾、燥濕理氣解毒之功效。對(duì)病理確診的術(shù)后復(fù)發(fā)或未能手術(shù)的晚期胃癌、大腸癌患者，在化療方案的基礎(chǔ)上，加用具有健脾化濕解毒作用的中藥復(fù)方，與單純化療組對(duì)比，中藥復(fù)方加化療組生存質(zhì)量明顯提高，中位生存期明顯延長(zhǎng)[4,5]。

奧沙利鉑(L-OHP)是近年來(lái)被推薦的II、III期結(jié)直腸癌的一線治療藥物，是繼順鉑、卡鉑后推出的第三代鉑類抗癌藥，其特點(diǎn)是對(duì)耐順鉑、卡鉑細(xì)胞株均有顯著的抑制作用[16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)逐步增加作用于親代細(xì)胞HCT 116的L-OHP濃度與間斷大劑量L-OHP作用，建立耐藥細(xì)胞HCT 116/L-OHP[17]，采用皮下接種的方式建立結(jié)腸癌皮下異位瘤模型，觀察了腸胃清煎劑對(duì)L-OHP治療結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞皮下移植瘤的增效作用。研究結(jié)果顯示，腸胃清煎劑聯(lián)合L-OHP組荷瘤小鼠體重減輕影響均少于化療組，尤其是對(duì)HCT 116/L-OHP耐藥細(xì)胞異位瘤裸鼠體重的減輕影響效果更為顯著，表明腸胃清煎劑可以減少L-OHP的毒副作用。同樣，腸胃清煎劑具有一定抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，在聯(lián)合化療藥物作用下，其抑制效果明顯，以耐藥細(xì)胞異位瘤體更為顯著，表明腸胃清煎劑可以對(duì)L-OHP治療耐藥結(jié)腸癌具有增敏作用。而且，在有效治療劑量中，與腸胃清煎劑劑量存在量效關(guān)系。

隨著對(duì)腫瘤多藥耐藥機(jī)制研究的深入，逆轉(zhuǎn)耐藥治療已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)之一，而耐藥機(jī)制的復(fù)雜性決定了理想的逆轉(zhuǎn)藥物應(yīng)該具有多靶點(diǎn)效應(yīng)。中藥復(fù)發(fā)的多靶點(diǎn)特性，在腫瘤治療中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，臨床實(shí)踐證明腸胃清煎劑具有良好的減毒增效作用，且體外研究已表明中藥逆轉(zhuǎn)耐藥的有效性。本研究亦表明，化療藥物聯(lián)合腸胃清煎劑后，其抑制裸鼠體內(nèi)耐藥皮下移植瘤的作用明顯得到增強(qiáng)，其增效作用與增加瘤體內(nèi)的藥物濃度有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制目前尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

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