李美妮 韓蕊蓮 韓建萍 姚輝 羅焜 宋經(jīng)元

大黃Radix et Rhizoma Rhei為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL．、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim．ex Balf．或藥用大黃RheumofficinaleBaill．的干燥根及根莖[1]。掌葉大黃及唐古特大黃商品習(xí)稱西大黃；藥用大黃商品習(xí)稱雅黃、南大黃。大黃具有瀉腸通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效。大黃為常用中藥，用量較大，當(dāng)藥源供不應(yīng)求時(shí)，有些地方用土大黃代替大黃使用[2]，這就影響了大黃準(zhǔn)確、安全的臨床效用。土大黃為蓼科植物鈍葉酸模RumexobtusifoliusL.、羊蹄RumexjaponicusHoutt.、尼泊爾酸模RumexnepalensisSpreng、網(wǎng)果酸模RumexchalepensisMill.和巴天酸模RumexpatientisL.的根及根莖[3]。土大黃具有止血、清熱解毒和消腫的功效。以往的研究已經(jīng)從來(lái)源、性狀、顯微、理化、功能及主治等幾方面對(duì)大黃和土大黃進(jìn)行了鑒別[4]。另外，《中國(guó)藥典》記載的藥材虎杖的原植物蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.與大黃也常常容易被混淆?；⒄染哂徐铒L(fēng)利濕、散瘀定痛、祛痰的功效。

植物DNA條形碼就是利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段快速、準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定植物種類[5],已成為近年來(lái)生物分類學(xué)研究的熱點(diǎn)之一和物種鑒定的一種有力工具。自陳士林等和Yao等[6，7]提出ITS2序列可以作為藥用植物乃至植物潛在的候選條形碼以來(lái)，對(duì)于不同科屬如薔薇科、大戟科、菊科、豆科、蕓香科、景天屬、黃芪屬、重樓屬、豆蔻屬[8-16]，該序列均能成功鑒定相關(guān)近緣物種，而且在中藥及其混偽品鑒定中顯示了極大的應(yīng)用前景，如筋骨草、砂仁、金錢草、京大戟、黨參、藁本、小茴香、威靈仙、大青葉、赤芍、高良姜、垂盆草[13，17-27]。ITS2序列短，一般為200 bp左右，容易被成功擴(kuò)增和測(cè)序，甚至對(duì)一些降解的藥材及粉末也能進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)研究所需材料少，結(jié)果不受環(huán)境因素及物種發(fā)育階段的影響，對(duì)于形態(tài)學(xué)上難鑒定的密切相關(guān)種具有鑒定準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。宋經(jīng)元等[28]已經(jīng)用trnH-psbA序列成功區(qū)分開了包括大黃、虎杖在內(nèi)的蓼科18個(gè)物種，本文擬用已經(jīng)被廣泛使用的ITS2序列對(duì)中藥大黃與其混偽品土大黃、虎杖原植物進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

材料來(lái)源如表1所示，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定。其中有標(biāo)本號(hào)的為實(shí)驗(yàn)材料的序列，實(shí)驗(yàn)原材料為硅膠干燥的葉片。其余序列信息下載自GenBank，下載時(shí)間為2011年9月。

1.2 方法

提取DNA、PCR和測(cè)序：參見前人研究[6]。

數(shù)據(jù)分析：拼接序列去除引物序列，然后去除5.8S和26S編碼區(qū)得到ITS2序列，最后計(jì)算K2P遺傳距離并基于此建立系統(tǒng)發(fā)生樹[27]。

表1 材料來(lái)源

2 結(jié)果

2.1 大黃種內(nèi)序列比對(duì)分析

由于中藥大黃屬于多基原藥材，所以分析時(shí)不僅考慮了各個(gè)基原內(nèi)的種內(nèi)序列比對(duì)，還有基原間的種間序列比對(duì)。除了藥用大黃種內(nèi)序列有1個(gè)堿基插入缺失外，供試掌葉大黃和唐古特大黃的種內(nèi)序列均完全相同。大黃種內(nèi)比對(duì)長(zhǎng)度為187 bp，有14個(gè)堿基變異。見圖1。

2.2 大黃與其混偽品土大黃、虎杖的種間序列比對(duì)分析

將土大黃的三個(gè)基原植物作為一個(gè)整體，與大黃的三個(gè)基原整體序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)后序列長(zhǎng)度為218 bp,有83個(gè)堿基的變異，另有41個(gè)堿基插入或缺失?；⒄扰c大黃的三個(gè)基原整體比對(duì)后序列長(zhǎng)度為201 bp,有61個(gè)堿基變異，另有17個(gè)堿基插入或缺失。如圖1所示。

2.3 大黃與其混偽品土大黃、虎杖的K2P遺傳距離分析

大黃的三個(gè)基原種內(nèi)、種間的K2P距離，大黃的三個(gè)基原分別與土大黃的三個(gè)基原、虎杖間的K2P距離如表2所示。根據(jù)表2計(jì)算大黃的種內(nèi)K2P距離，與土大黃、虎杖的種間K2P距離，結(jié)果見表3。種間最小K2P距離(38.6%)大于種內(nèi)最大K2P距離(8.0%)，因此ITS2序列能夠識(shí)別大黃原植物及其混偽品土大黃和虎杖。

圖1 大黃、土大黃、虎杖種內(nèi)種間ITS2序列比對(duì)

Rh．officinaleRh．palmatumRh．tanguticumRh．officinale0Rh．palmatum1．10Rh．tanguticum6．88．00Ru．japonicus45．544．547．6Ru．nepalensis47．546．748．7Ru．obtusifolius47．146．449．4Polygonumcuspidatum39．939．638．6

表3 大黃及其混偽品的種內(nèi)種間K2P距離統(tǒng)計(jì)

2.4 聚類分析

從系統(tǒng)聚類樹中，可以看出中藥大黃的三個(gè)基原植物聚為一支，支持率為100，基于ITS2序列的K2P模型系統(tǒng)聚類樹能夠?qū)⒋簏S與土大黃、虎杖成功地區(qū)分開。中藥土大黃三個(gè)基原植物聚為一支，支持率為99，土大黃能夠與虎杖相區(qū)別。基于聚類分析表明，ITS2序列可以準(zhǔn)確區(qū)分大黃原植物及其混偽品土大黃和虎杖。見圖2。

3 討論

本文分析了大黃、土大黃、虎杖基原植物編碼核糖體RNA的核基因的ITS2序列的K2P距離，并基于K2P距離建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹，均證明ITS2序列可以準(zhǔn)確鑒定這三種藥材及不同基原植物，為大黃及其混偽品的鑒別提供了新的分子水平的研究方法。雖然對(duì)于土大黃3個(gè)基原沒(méi)有完全區(qū)別開，但條形碼技術(shù)并非只局限于單個(gè)物種，如一群聚集的個(gè)體、一群界限不明的物種[29]，因此本文將土大黃作為一個(gè)整體的研究思路是可以接受的。另外從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出土大黃的其中三個(gè)基原植物先聚在一起成為一支后，支持率為99，再與虎杖聚為一大支，說(shuō)明土大黃與虎杖的親緣關(guān)系較大黃近，這與臨床應(yīng)用上虎杖和土大黃經(jīng)常混淆的現(xiàn)象一致。從系統(tǒng)發(fā)生樹又可以看出藥用大黃的4個(gè)不同樣品來(lái)源先與掌葉大黃的2個(gè)不同樣品來(lái)源聚為一支，支持率為91，然后再與唐古特大黃聚為一支，即藥用大黃與掌葉大黃的親緣關(guān)系較唐古特大黃更近。這與索風(fēng)梅等[30]通過(guò)分析大黃三個(gè)基原AFLP，研究其親緣關(guān)系的結(jié)果一致。從而更進(jìn)一步說(shuō)明植物DNA條形碼技術(shù)為中藥鑒定提供了有力的依據(jù)，也對(duì)植物系統(tǒng)分類工作起到了輔助作用。值得提醒的是，提取大黃DNA時(shí)應(yīng)特別關(guān)注真菌污染，尤其是根部。可以通過(guò)BLAST方法對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)查錯(cuò)，保證后續(xù)的分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

中藥是一個(gè)復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)體系，發(fā)揮療效通過(guò)多成分、多層次、多靶點(diǎn)和多途徑作用于人體，所以難以從某1～2種成分對(duì)其進(jìn)行鑒定，反應(yīng)藥品的內(nèi)在質(zhì)量。因此，在結(jié)合傳統(tǒng)的形狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等傳統(tǒng)鑒定方法的基礎(chǔ)上，能夠成功利用一些現(xiàn)代化分析技術(shù)例如近幾年的研究熱點(diǎn)技術(shù)——DNA條形碼技術(shù)鑒別中藥真?zhèn)?，這一結(jié)論無(wú)疑給中藥鑒定工作帶來(lái)了極大的促進(jìn)和希望。

圖2 基于K2P模型的ITS2序列的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹圖(bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)

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