楊鴻 吳彥 馬琰巖 呂俊海 李晶哲

隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥的配伍組方研究已經(jīng)從傳統(tǒng)的飲片層次上升到組分層次，中藥有效組分配伍已經(jīng)成為中藥創(chuàng)新研究的一種新模式[1]，創(chuàng)新與延伸了方劑配伍理論。進(jìn)行組分配伍研究的關(guān)鍵問(wèn)題之一，是針對(duì)特定臨床疾病和藥效指標(biāo)，如何獲得各組分的最佳劑量效應(yīng)配比，從而能夠定量描述中藥組分與藥效之間的關(guān)系。由于中藥成分的復(fù)雜性和量效關(guān)系的非線性特征，與其相適應(yīng)的研究?jī)?yōu)化方法需要具備非線性擬合能力，同時(shí)也要注重中藥組分配伍研究的高效性、實(shí)用性和可靠性。其中均勻設(shè)計(jì)適合于多因素多水平的實(shí)驗(yàn)研究，能夠定量分析預(yù)測(cè)優(yōu)化結(jié)果，在最佳劑量配比的確定方面發(fā)揮了較好的作用[2]。本文在前期單味中藥組分藥效研究[3]的基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)理論指導(dǎo)，篩選銀杏葉提取物、淫羊藿總黃酮、黃芪總苷和甘草總黃酮組成了中藥組分復(fù)方，采用均勻設(shè)計(jì)結(jié)合改進(jìn)最小角回歸(Improved least angle regression，Improved LARS)分析，以清除DPPH自由基能力為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)——藥效試驗(yàn)——數(shù)學(xué)建模及模型驗(yàn)證評(píng)價(jià)程序，進(jìn)行了抗氧化中藥有效組分復(fù)方篩選評(píng)價(jià)的方法學(xué)研究探索，為探索適合中藥組效關(guān)系的研究方法提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及受試藥品

DPPH，美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品，批號(hào)S90790-379；無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：20091216。甘草總黃酮，規(guī)格90%，批號(hào)091015；銀杏葉提取物，規(guī)格24%黃酮和6%內(nèi)酯，批號(hào)091015；淫羊藿總黃酮，規(guī)格70%，批號(hào)091108；黃芪總苷，規(guī)格50%，批號(hào)091015；均為南京朗澤醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備與軟件工具

DU730型蛋白核酸分析儀，美國(guó)BECKMAN公司產(chǎn)品；BT25S十萬(wàn)分之一電子分析天平，德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品。

“組分優(yōu)化軟件v1.0”由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院楊洪軍老師提供。

1.3 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案

按照水平數(shù)應(yīng)大于因素?cái)?shù)2倍的均勻設(shè)計(jì)原則，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為4因素12水平，采用均勻設(shè)計(jì)方案U12(124)表進(jìn)行劑量配比關(guān)系研究；4種中藥有效組分甘草總黃酮、銀杏葉提取物、淫羊藿總黃酮和黃芪總苷作為考察因子，根據(jù)實(shí)際需要，甘草總黃酮和銀杏葉提取物設(shè)計(jì)為12個(gè)劑量水平；淫羊藿總黃酮和黃芪總苷由于受限于劑量范圍較小，采用擬水平方式，設(shè)計(jì)6個(gè)劑量水平，循環(huán)一次達(dá)到12個(gè)水平。均勻試驗(yàn)安排見表1。

1.4 中藥組分配伍清除DPPH自由基的測(cè)定方法[4]

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)是判定藥物體外抗氧化活性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，具有靈敏度高，重復(fù)性好，誤差較小等特點(diǎn)，具體方法如下：

將DPPH用無(wú)水乙醇配置成濃度為25 mg/L備用。配置各實(shí)驗(yàn)編組藥物濃度，使反應(yīng)體系藥物總濃度恒定為0.05 mg/ml。在試管中依次加入2 ml DPPH溶液和0.5 ml 70%醇溶液(樣品溶解溶劑)，混勻后用1 cm比色皿在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值(A)，記為A0；加入2 ml DPPH溶液和0.5 ml待測(cè)中藥組分復(fù)方試液,混勻后在黑暗處?kù)o置30分鐘，測(cè)定記為Ai；加入2 ml無(wú)水乙醇溶液和0.5 ml待測(cè)中藥組分復(fù)方試液,混勻后測(cè)定值,記為Aj，按下式計(jì)算自由基清除率。清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，清除率采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表1 U12(124)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.5 LARS回歸分析、多元線性回歸分析及中藥組分復(fù)方劑量配比優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別采用Improved LARS分析方法、多元線性回歸分析方法，通過(guò)“組分優(yōu)化軟件”，獲得四組分配伍清除DPPH的回歸方程，結(jié)合實(shí)際進(jìn)行人工優(yōu)化，獲得優(yōu)化配伍結(jié)果，按照2.2方法再次進(jìn)行優(yōu)化配伍測(cè)試和驗(yàn)證，獲得清除DPPH的最優(yōu)配比，通過(guò)比較分析兩種回歸方法的差異。

2 結(jié)果

2.1 中藥有效組分配伍對(duì)DPPH自由基的清除作用

根據(jù)均勻設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，四味中藥有效組分不同配比組合對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用，其中實(shí)驗(yàn)2為實(shí)際清除DPPH效果最好的組合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

表2 中藥組分均勻?qū)嶒?yàn)配伍組合對(duì)DPPH清除率

2.2 均勻試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析

根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Improved LARS和多元線性回歸分析分別獲得四組分配伍清除DPPH的回歸方程，其中甘草總黃酮為X1，銀杏葉提取物為X2，淫羊藿總黃酮為X3，黃芪總苷為X4，平均清除率為Y；從所建立的成分組合與藥效間的Improved LARS數(shù)學(xué)模型中看出，在清除DPPH自由基方面既有各有效組分的單獨(dú)作用，也有它們兩兩之間的交互作用，既可“增效”也有“拮抗”作用，能夠顯示出中藥多組分配伍的復(fù)雜性和非線性；而線性回歸方程僅顯示了各單個(gè)組分的作用，而沒(méi)有反應(yīng)出組分間的交互影響?；貧w方程如下：

(1)中藥組分配伍清除DPPH的LRAS回歸方程

Y=(1348.41024529341)×X1

+(1902.85081030458)×X2

+(0.432341713582079)×X3

+(-20.861132023621)×X4

+(-11511.5692665415)×X1×X2

+(6495.11575739643)×X1×X3

+(18840.5788500999)×X2×X4

+(1287.76729516979)×X1×X1

(2)中藥組分配伍清除DPPH的多元線性回歸方程

Y=(-1371.24900228961)

+(28648.4949869476)×X1

+(29276.1810839307)×X2

+(27530.7710541729)×X3

+(27748.8885934949)×X4

2.3 優(yōu)化配伍結(jié)果及其驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上回歸方程并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行人工優(yōu)化，獲得該中藥有效組分復(fù)方的2個(gè)優(yōu)化配伍預(yù)測(cè)組合，同時(shí)為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性設(shè)計(jì)了另兩個(gè)配伍組合。將這四個(gè)組合和實(shí)際檢測(cè)最佳組合進(jìn)行了清除DPPH的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示清除DPPH效果以預(yù)測(cè)A組合為最優(yōu)(甘草總黃酮0.8 mg/ml、銀杏葉提取物3.144 mg/ml、淫羊藿總黃酮0.024 mg/ml和黃芪總苷0.036 mg/ml)，不僅優(yōu)于均勻設(shè)計(jì)實(shí)際檢測(cè)最佳組合的清除作用，同時(shí)也要強(qiáng)于其組成各單味組分中藥的作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果與通過(guò)Improved LARS和多元線性分析獲得的預(yù)測(cè)趨勢(shì)是一致的，在預(yù)測(cè)結(jié)果方面顯示兩種分析方法差別不大，然而從Improved LARS數(shù)學(xué)模型中能夠顯示出中藥多組分配伍的復(fù)雜性和非線性，而線性回歸模型則反應(yīng)不出各組分間的相互作用。因此綜合看來(lái)，依據(jù)Improved LARS算法所建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)中藥組分配伍來(lái)說(shuō)更為適合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 中藥組分優(yōu)化組合清除DPPH的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證結(jié)果

注：上述劑量為原始藥物配置濃度

3 討論與結(jié)論

在中藥有效組分復(fù)方的配伍研究中，用于定量描述中藥組分與藥理效應(yīng)之間關(guān)系時(shí)，需要借助適宜的數(shù)學(xué)分析建模方法。目前，常用的中藥組分配伍優(yōu)選設(shè)計(jì)方法有正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、基線等比增減設(shè)計(jì)、配伍計(jì)量分析法、藥對(duì)協(xié)同效應(yīng)設(shè)計(jì)、極性分段篩選設(shè)計(jì)等[5-8]，各有特點(diǎn)：如正交設(shè)計(jì)具有試驗(yàn)點(diǎn)分布均衡、整齊可比，但實(shí)驗(yàn)次數(shù)較多等特點(diǎn)；基線等比增減設(shè)計(jì)、配伍計(jì)量分析法和藥對(duì)協(xié)同效應(yīng)設(shè)計(jì)適合于兩種藥物的配比優(yōu)化研究；極性分段篩選設(shè)計(jì)則適合于藥物極性有明顯差別的復(fù)方組分篩選。而針對(duì)目前日益增多的中藥有效部位和單體組分，該如何選擇合適的研究方法，切實(shí)有效的進(jìn)行多組分中藥復(fù)方的配伍研究則日益迫切。本研究顯示均勻設(shè)計(jì)可以在最佳劑量配比確定方面發(fā)揮較好的作用，其優(yōu)點(diǎn)在于適合多因素、多水平的實(shí)驗(yàn)研究。在同等情況下，不僅試驗(yàn)次數(shù)較正交設(shè)計(jì)大為減少，而且通過(guò)分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，能夠定量分析各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，定量地預(yù)報(bào)優(yōu)化條件及優(yōu)化結(jié)果的區(qū)間估計(jì)。所采用的Improved LARS回歸數(shù)據(jù)分析方法，屬于一種非線性多元回歸算法，符合中藥復(fù)方量效關(guān)系研究中的非線性特征，對(duì)于偏差較大的數(shù)據(jù)依然能夠給出良好的擬合能力，符合生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)離散度較大的特點(diǎn)，適合“非線性、小樣本”的中藥多組分與生物效應(yīng)間數(shù)據(jù)分析和關(guān)系描述。

本次研究根據(jù)均勻設(shè)計(jì)原理獲得了12組中藥組分不同配比的DPPH清除率數(shù)據(jù)，依據(jù)Improved LARS進(jìn)行了數(shù)學(xué)分析建模，獲得了優(yōu)化組合的預(yù)測(cè)清除率，驗(yàn)證結(jié)果顯示最佳組合不僅優(yōu)于均勻設(shè)計(jì)中實(shí)際檢測(cè)最佳組合的清除作用，同時(shí)也要強(qiáng)于其組成各單味組分中藥的作用。由于生物實(shí)驗(yàn)自身的離散度等原因，不同批次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會(huì)有波動(dòng)，但不同組合優(yōu)劣排序與預(yù)測(cè)排序結(jié)果是一致的，說(shuō)明該方法適合生物數(shù)據(jù)的分析，具有良好的預(yù)測(cè)性，用于中藥組分配比篩選是可行的。同時(shí)，在運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行組分配伍研究時(shí)需要注意以下問(wèn)題：

(1)恒定配比藥物反應(yīng)總量：由于在劑量配比研究中存在著量效關(guān)系的干擾，因此在使用均勻設(shè)計(jì)表安排配比實(shí)驗(yàn)時(shí)需要排除這種影響，通過(guò)恒定每個(gè)組合在藥效反應(yīng)體系中的總量，可以保證結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性。

(2)藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇：在效應(yīng)評(píng)價(jià)過(guò)程中應(yīng)選擇特異性高、生物離散度較低、重復(fù)性較好的定量指標(biāo)，這樣獲得的回歸方程擬合性較好，預(yù)測(cè)最佳劑量配比準(zhǔn)確度高。

(3)中藥作用具有多成分、多靶點(diǎn)特性，有效組分復(fù)方的總效應(yīng)也非單一組分單獨(dú)作用的線性疊加，而是既可“增效”也可“拮抗”，顯示出配伍研究的復(fù)雜性和非線性特征。

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