徐 麗，何 娟，聞伴康，羅簡(jiǎn)勝，潘堪尚

(廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山 528458)

釕多吡啶金屬配合物具有豐富的光物理﹑光化學(xué)性質(zhì)，能夠用來(lái)設(shè)計(jì)DNA分子探針，DNA分子光開(kāi)關(guān)和特定位置的DNA斷裂試劑[1]。近年來(lái)的研究表明釕(Ⅱ)多吡啶金屬配合物還具有斷裂和壓縮DNA特性[2-3]。隨著人們對(duì)金屬配合物與DNA作用的深入研究，普遍認(rèn)為小分子化合物與DNA的作用方式有共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合，非共價(jià)結(jié)合包括靜電作用、面式結(jié)合和插入結(jié)合三種作用機(jī)理，而許多重要的應(yīng)用要求配合物以插入方式與DNA結(jié)合。本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)新穎的釕(Ⅱ)多吡啶配合物。在后續(xù)的研究中采用元素分析，質(zhì)譜和1H NMR對(duì)其進(jìn)行表征，用電子吸收光譜、黏度測(cè)試、Job-plot熒光滴定法等手段系統(tǒng)研究配合物與DNA作用機(jī)理。通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究該配合物誘導(dǎo)pBR322DNA斷裂及壓縮pGL3 DNA。

1 實(shí)驗(yàn)材料，儀器與方法

1.1 試劑和儀器

所用化學(xué)試劑均為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化。小牛胸腺DNA購(gòu)自華美公司，配合物用5 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl(pH=7.2)緩沖溶液配制。LCQ電噴霧質(zhì)譜儀(ESMS,Finnigan)，Perkin-Elmer240元素分析儀，Bruker DRX-500型核磁共振儀，Shimadzu UV-2501 PC型紫外-可見(jiàn)光譜儀，Ubbelodle黏度測(cè)定儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

紫外-可見(jiàn)吸收光譜實(shí)驗(yàn)中，在參比池和樣品池中分別加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收，當(dāng)配合物的電子吸收光譜不再變化，此時(shí)吸收滴定達(dá)到飽和。配合物與DNA結(jié)合常數(shù)根據(jù)下列方程求得[4]

式中，εa，εf，εb分別是配合物與DNA結(jié)合、自由配合物和配合物與DNA結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)的摩爾吸光系數(shù)，K為結(jié)合常數(shù)。測(cè)量黏度時(shí)，溫度固定在(25±0.1)℃。測(cè)試液配制方法:固定DNA的濃度，逐漸增加配合物的濃度，相對(duì)黏度按下式計(jì)算

η= (t-t0)/t0

式中，t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，t為DNA溶液(含不同濃度的配合物)流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間。以(η/η0)1/3對(duì)結(jié)合比率r(r=[Ru]/[DNA])作圖。η0為未加配合物的溶液的相對(duì)黏度；配合物與CT DNA結(jié)合比的計(jì)算通過(guò)jot-polt熒光滴定曲線獲得。配制釕配合物和CT DNA的混合溶液，使[配合物]/[CT DNA]的比值按一定的比例逐步遞增,但保持它們的總濃度為 50 μmol/L。在500～750 nm范圍監(jiān)測(cè)配合物的熒光光譜變化。用460 nm光源激發(fā)，記錄發(fā)射光波峰和發(fā)光強(qiáng)度。通過(guò) Job-plot曲線找到配合物與CT DNA結(jié)合比。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳光斷裂實(shí)驗(yàn)及配合物壓縮pGL 3 DNA

將0.5 μg/μL pBR322 質(zhì)粒DNA 溶液原液稀釋為0.1 μg/μL,在0 ℃下保存。用TBE電泳緩沖液(pH 7.5)配制ρ=1.2％的瓊脂糖凝膠。向容量200 μL 的eppendorf微量反應(yīng)管加入1 μL pBR322DNA溶液,加入緩沖液,并加入1 μL 一定濃度的配合物溶液,再混勻并使反應(yīng)液的終體積保持在10 μL。 然后用365 nm 波長(zhǎng)的紫外光下照射30 min后,加入10×loading buffer 凝膠載樣緩沖液1 μL。加樣并使用成都比郎BG-Power-600型通用電泳儀在90 V,75 mA的恒壓恒流下電泳90 min,結(jié)果用Alpha Innotech IS-5500全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置拍攝,并用BANDSCAN 生物圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理。

1.4 抗氧化機(jī)理實(shí)驗(yàn)

抗氧化機(jī)理實(shí)驗(yàn)是依據(jù)Fenton體系產(chǎn)生羥基自由基，研究配合物(DMF介質(zhì)中溶解)對(duì)清除羥基自由基的效果，進(jìn)而推測(cè)配合物的抗氧化活性[5]。實(shí)驗(yàn)測(cè)試的5 mL溶液中含有如下物質(zhì)：番紅精(28.5 μmol/L),EDTA-Fe(Ⅱ)(100 μmol/L),雙氧水(44.0 μmol/L),所測(cè)試的配合物(0.2～1.4 μmol/L)和磷酸鹽緩沖液(67 mmol/L)。測(cè)試溶液在37 ℃水浴中孵育30 min后，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)試吸光度值3次，求平均值。依據(jù)公式(Ai-A0)/(Ac-A0)× 100％計(jì)算配合物對(duì)羥基自由基的清除率而得知配合物的抗氧化能力的大小。式中，Ai是測(cè)試配合物存在時(shí)的吸光度值，Ac是配合物、EDTA-Fe(Ⅱ)和雙氧水不存在時(shí)的吸光度值，A0是配合物不存在時(shí)的吸光度值。

1.5 配合物[Ru(dip)2(DBHIP)](ClO4)2的合成與表征

稱取cis-[Ru(dip)2Cl2]·2H2O 0.436 g (0.5 mmol)和DBHIP 0.235 g (0.5 mmol)放入30 mL乙二醇中，加熱至150 ℃氬氣保護(hù)下反應(yīng)8 h,得紅色清液[ 6-7 ]。冷卻至室溫，過(guò)濾，加40 mL水稀釋后，加入NaClO4的飽和溶液即產(chǎn)生大量紅色沉淀，抽濾，干燥。將干燥后的粗產(chǎn)品用少量乙腈溶解，用中性氧化鋁(200目)柱分離。用乙腈-甲苯(V∶V=3∶1)混合溶劑淋洗下收集紅色組分。然后減壓，蒸去溶劑，得紅色晶體。產(chǎn)率65％。 C67H42N8Br2O9Cl2Ru元素分析計(jì)算值(w/％):C,56.08; H,2.95; N,7.81％; 實(shí)測(cè)值(w/％): C,55.94; H,2.76; N,8.02％。ES-MS (CH3OH)m/z: 1 335.5 [(M-ClO4)]+,1 235.7 [(M-2ClO4-H)]+,618.3 [(M-2ClO4)]2+。1H NMR(DMSO-d6)δ:9.13 (d,2H,J= 8.0 Hz),8.47 (s,4H),8.34 (d,4H,J= 5.5 Hz),8.27 (d,2H,J= 5.0 Hz),8.18 (d,4H,J= 5.5 Hz),7.91 (s,2H),7.82 (d,2H,J= 5.5 Hz),7.71～7.58 (m,20H)。

配合物的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 配合物[Ru(dip)2(DBHIP)]2+的結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物與DNA相互作用的電子光譜研究

隨著小牛胸腺DNA加入，配合物的電子吸收光譜發(fā)生減色和一定程度紅移。對(duì)于配合物，金屬到配體電荷躍遷(MLCT)峰(460 nm)，在室溫時(shí)減色率為22.3％，紅移3 nm(圖2)，這是因?yàn)榕浜衔锏牟迦肱潴w插入到DNA堿基對(duì)之間，與堿基對(duì)發(fā)生π電子堆積后，其π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，能級(jí)下降，從而導(dǎo)致π-π*躍遷能量減小，產(chǎn)生紅移；同時(shí)，偶合后的π軌道因部分填充電子，使π -π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)。配合物與DNA作用的結(jié)合常數(shù)為K=1.91×104mol·L，配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)與經(jīng)典的嵌入鍵合配合物的鍵合常數(shù)(1.1×104～4.8×104mol·L)相近，這一結(jié)果說(shuō)明配合物與DNA之間可能是通過(guò)插入作用結(jié)合的。

圖2 Tris-HCl緩沖溶液中配合物與DNA 作用紫外可見(jiàn)光譜變化圖

2.2 黏度測(cè)試

配合物與小牛胸腺DNA以插入方式結(jié)合時(shí)，DNA溶液的黏度增加，以部分插入方式與DNA結(jié)合時(shí)，DNA溶液的黏度降低；以靜電或溝面方式結(jié)合時(shí)，DNA溶液的黏度變化不大。圖3表示配合物與DNA作用黏度變化圖。配合物是典型的DNA插入試劑，與DNA溶液作用時(shí)黏度明顯升高。

圖3 恒溫(25±0.1)℃，當(dāng)溶液中[DNA]=0.25 mmol/L時(shí)，按照一定比例增加配合物濃度得到的黏度變化圖

2.3 配合物與CT DNA相互作用的結(jié)合計(jì)量比

我們采用了Job-plot熒光滴定法確定配合物與CT DNA作用比例(如圖4)[8]。不同比例但總濃度保持一致的系列配合物-DNA混合樣品進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。讀取配合物的特征發(fā)射峰值，將發(fā)射峰值對(duì)配合物的百分含量作圖，擬合線的拐點(diǎn)相應(yīng)x軸讀數(shù)即為飽和反應(yīng)的配合物的含量。結(jié)果顯示配合物和CT DNA的Job-plot擬合線的拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)x值為0.63即配合物與CT DNA的結(jié)合比例為2∶1。

圖4 配合物與DNA job-plot 熒光曲線圖

2.4 配合物的不同濃度梯度對(duì)質(zhì)粒DNA 的光切割影響

質(zhì)粒DNA 通常有3種構(gòu)型： Form Ⅰ 為共價(jià)閉環(huán)超螺旋型,其結(jié)構(gòu)緊密,電泳遷移速率最快; Form Ⅱ 為開(kāi)環(huán)缺刻型，雙鏈中的一條出現(xiàn)了一個(gè)至幾個(gè)切口，其結(jié)構(gòu)松散,電泳遷移速率最慢；Form Ⅲ 型為開(kāi)放的線狀結(jié)構(gòu)，DNA 雙鏈在同一部位被切斷，電泳遷移速率介于前兩者。 在相同條件下，利用瓊脂糖凝膠電泳法研究了在不同濃度情況下的配合物[Ru(dip)2(DBHIP)](ClO4)2與DNA 結(jié)合并經(jīng)紫外線照射后對(duì)DNA 的切割情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。 由圖可知，在365 nm 的紫外線照射下，不同濃度的[Ru(dip)2(DBHIP)](ClO4)2都具有光切割DNA 的性質(zhì)。 研究結(jié)果表明隨著濃度的增加，配合物對(duì)DNA 切割作用越來(lái)越強(qiáng)。圖中pBR322 DNA 的Form Ⅰ型的量隨著配合物濃度的上升不斷被切割轉(zhuǎn)化為Form Ⅱ 型。

圖5 在365 nm 的紫外光照射30 min 后不同濃度配合物對(duì)pBR322 質(zhì)粒DNA進(jìn)行光切割的凝膠電泳圖

2.5 配合物壓縮pGL3 DNA

配合物與超螺旋質(zhì)粒pGL3 DNA作用后，如果能誘導(dǎo)DNA發(fā)生縮合，DNA體積將增大，因而在凝膠中的遷移速率減少，遷移距離變短。隨著配合物的濃度的增加，DNA的遷移距離逐漸減少直至為零，配合物能壓縮DNA[9]。圖6為配合物壓縮pGL3 DNA的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)圖。從圖中可以看出，在配合物的濃度≤ 4 mmol/L時(shí)，隨著濃度的不斷增大，F(xiàn)orm Ⅰ逐漸變少；隨著濃度逐漸增大到6 mmol/L時(shí)， Form Ⅰ已經(jīng)完全消失。

圖6 配合物壓縮DNA凝膠電泳圖

2.6 配合物抗氧化機(jī)理研究

人體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)主要是通過(guò)羥基自由基和超氧陰離子引起DNA的損傷。這種損傷是導(dǎo)致人衰老而且被認(rèn)為是破壞性最強(qiáng)的損傷。因此，消除此類(lèi)自由基是抗氧化性實(shí)驗(yàn)的主要目標(biāo)。我們根據(jù)配合物消除羥基自由基能力的大小考察配合物的抗氧化性能力大小(圖7)。當(dāng)配體形成配合物以后，抗氧化能力明顯增強(qiáng)。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文合成了釕一個(gè)新的(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(dip)2(DBHIP)](ClO4)2，用元素分析、質(zhì)譜和1HNMR進(jìn)行表征，通過(guò)電子吸收滴定、黏度和Job-plot熒光滴定實(shí)驗(yàn)研究配合物與DNA作用，結(jié)果表明配合物與DNA之間以插入方式結(jié)合。進(jìn)一步通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)研究表明配合物誘導(dǎo)pBR322DNA斷裂及壓縮pGL3 DNA?？寡趸詫?shí)驗(yàn)表明配合物在較低濃度時(shí)顯示出較高的清除羥基自由基的能力，同時(shí)它的抗氧化能力強(qiáng)于配體。這主要是因?yàn)榕潴w鍵合到中心金屬離子形成配合物增強(qiáng)了配體的抗氧化性能。

參考文獻(xiàn)：

[1]MAHESWARI P U,PALANIANDAVAR M.DNA binding and cleavage activity of [Ru(NH3)4(diimine)]Cl2complexes[J].Inorg Chim Acta,2004,357(4): 901-912.

[2]LIU Y J,LIANG Z H,LI Z Z,et al.Cellular uptake,cytotoxicity,apoptosis,antioxidant activity and DNA binding of polypyridyl ruthenium(II)complexes [J].J Organomet Chem,2011,696: 2728-2735.

[3]SUN B,GUAN J X,XU L,et al.DNA condensation induced by ruthenium(II)polypyridyl complexes[Ru(bpy)2(PIPSH)]2+and [Ru(bpy)2(PIPNH)]2+[J].J Inorg Chem,2009,48:4637-4639.

[4]WOLF A,SHIMER Jr G H,MEEHAN T.Polycyclic aromatic hydrocarbons physically intercalate into duplex regions of denatured DNA [J].Biochemistry,1987,26: 6392-6396.

[5]HICKMAN J A.Apoptosis induced by anticancer drugs [J].Cancer Metast Rev,1992,11:121-139.

[6]SULLIVAN B P,SALMON D J,MEYER T J.Mixed phosphine 2,2’-bipyridine complexes of ruthenium [J].Inorg Chem,1978,17: 3334-3341.

[7]LIU Y J,ZENG C H,LIANG Z H,et al.Synthesis of ruthenium(II)complexes and characterization of their cytotoxicityinvitro,apoptosis,DNA-binding and antioxidant activity.[J] Eur J Med Chem,2010,45: 3087-3095.

[8]JOB P.Formation and stability of inorganic complexes in solution [J].Ann Chim (Paris),1928,9: 113-203.

[9]MANN A.DNA condensation by poly-L-lysine at the single molecule level: role of DNA concentration and polymer length [J].Journal of Controlled Release,2008,125: 252-262.