蔣依依，李言偉，周素明，李安興

(中山大學(xué)水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥生物防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275)

加州鱸學(xué)名大口黑鱸Micropterussalmoides，隸屬鱸形目Perciformes、太陽魚科Cehtrachidae、黑鱸屬M(fèi)icropterus，是我國引進(jìn)的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚類。目前我國的加州鱸年產(chǎn)量達(dá)16萬t以上，廣東則是加州鱸養(yǎng)殖大省，其中順德，南海地區(qū)的養(yǎng)殖量占全國的75％。近年來順德，南海等地池塘養(yǎng)殖的加州鱸出現(xiàn)了一種以體表和內(nèi)臟出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)為主要癥狀的傳染性疾病，該病病情持續(xù)時間長，死亡率高，嚴(yán)重威脅著加州鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本文對患病的加州鱸進(jìn)行了病原的分離鑒定、16S rDNA分析、動物回歸感染試驗(yàn)及藥物敏感性等方面的研究，以期為加州鱸諾卡菌病的有效防治提供理論參考，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 病魚癥狀和組織病理學(xué)觀察

患病加州鱸采自南海加州鱸養(yǎng)殖場，體長25～35 cm，體質(zhì)量400～600 g。取瀕死病魚與健康魚進(jìn)行體表和內(nèi)部解剖比較觀察，確定該病的典型癥狀。同時取出現(xiàn)典型癥狀的腎臟組織用φ=10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。

1.2 病原菌分離

以無菌操作從患病魚的肝、腎、脾、肌肉等病變組織取樣，分別劃線于血平板和BHI培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～8 d分離純化細(xì)菌，分離菌株編號為NH090627。

1.3 病原菌形態(tài)觀察

將分離純化后的細(xì)菌劃線轉(zhuǎn)接于BHI培養(yǎng)板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～8 d，觀察平板上的菌落形態(tài)。同時對分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下鏡檢觀察。

1.4 生理生化鑒定

按照參考文獻(xiàn)[1-2]的相應(yīng)屬、種鑒定的有關(guān)內(nèi)容和方法，用生化鑒定管(購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司)對分離菌株的酶類產(chǎn)生、水解活性、單一碳源生長等生理生化指標(biāo)進(jìn)行研究。

1.5 回歸感染試驗(yàn)

試驗(yàn)用加州鱸體長15～20 cm，體質(zhì)量30～45 g。試驗(yàn)前隨機(jī)取3尾魚解剖，并取其腦、肝、脾、腎和肌肉等組織涂板確定其有無細(xì)菌感染。試驗(yàn)魚分3組：1個試驗(yàn)組，1個PBS對照組，1個自然組，每組10尾魚。將分離菌株在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后稀釋成濃度為2.5×107cfu/mL菌懸液，試驗(yàn)組每尾魚腹腔注射0.2 mL菌液，PBS對照組注射同樣劑量的PBS，未處理組不做任何處理。感染后，試驗(yàn)魚飼養(yǎng)20 d,水溫20～25 ℃，隨時記錄試驗(yàn)魚的發(fā)病癥狀和死亡情況。

1.6 16S rDNA序列擴(kuò)增和分析

用Edwards等[3]設(shè)計的細(xì)菌16S rDNA通用引物(Pf：5’-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3’ 和Pr：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)擴(kuò)增分離菌株NH090627的16S rDNA序列，回收PCR產(chǎn)物，TA克隆后挑取陽性克隆測序，測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

所測得序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)返回的結(jié)果從GeneBank中調(diào)用諾卡菌屬其他種的16S rDNA序列，Clustalx軟件比對后，用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

取100 μL液體培養(yǎng)的菌液(108cfu/mL)與BHI培養(yǎng)基混勻后倒平板，然后將附有不同抗生素的藥敏紙片(購自英國Oxioid公司)均勻貼在平板上。28 ℃培養(yǎng)7 d后測量抑菌圈直徑。

2 結(jié) 果

2.1 病魚臨床癥狀和組織病理學(xué)觀察

患病魚游動緩慢，反應(yīng)遲鈍，上浮于水面，攝食量減少，每天大量死亡，持續(xù)周期長。隨病情加重，病魚體表開始充血發(fā)炎，逐漸潰爛，胸腹鰭和尾鰭均有潰爛出血癥狀，部分病魚肛門紅腫。鰓上粘液增多，部分魚鰓絲出現(xiàn)小出血點(diǎn)，邊緣缺損。解剖觀察肌肉和腎臟有明顯白色或淡黃色結(jié)節(jié)(圖1)，直徑1～5 mm，肝臟腫大，部分病魚肝臟有大量出血點(diǎn)。腎臟組織切片可發(fā)現(xiàn)有明顯肉芽腫狀病變(圖2)

圖1 患病加州鱸病變組織解剖結(jié)構(gòu)(示肌肉和腎臟白色結(jié)節(jié))

圖2 患病加州鱸腎臟組織切片(示腎臟肉芽腫狀病變，HE×1000)

2.2 病原菌形態(tài)觀察

病原菌在BHI培養(yǎng)基上生長緩慢，28 ℃需5～10 d才能形成淡黃色沙粒狀菌落,粗糙易碎,邊緣不整齊,在表面形成皺折。病原菌在血平板上生長稍快，28 ℃需2～5 d，無溶血，菌落形態(tài)與BHI平板上的菌落相似(圖3)。病原菌革蘭氏染色呈陽性，菌體呈紫紅色短桿狀或分枝狀，長2～5 μm(圖4)。

圖3 病原菌在血平板上的菌落形態(tài)

圖4 顯微鏡下的病原菌形態(tài)(×1000)

2.3 生理生化特征

如表1所示，病原菌過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生脲酶、還原硝酸鹽、不水解酪蛋白、黃嘌呤、酪氨酸、淀粉和明膠，水解七葉苷，能以檸檬酸鹽為唯一碳源生長，具備了諾卡菌屬細(xì)菌的基本生理生化特征。

2.4 回歸感染試驗(yàn)

加州鱸在腹腔注射諾卡菌5 d時即出現(xiàn)死亡，7 d后體表有發(fā)紅癥狀，到第16 d時10尾魚全部死亡，對照組無任何癥狀(表2)。

解剖發(fā)現(xiàn)病魚肝臟腫大，變白灰色，未見明顯白色結(jié)節(jié)，但從肝、脾、腎、肌肉組織中均能分離得到純度一致的細(xì)菌，菌落形態(tài)、菌體形態(tài)及基本生理生化特征與從自然發(fā)病魚體分離的菌株完全一致，說明所分離細(xì)菌即為加州鱸傳染性結(jié)節(jié)病的病原菌。

2.5 16S rDNA序列分析

用引物Pf和Pr擴(kuò)增菌株NH090627的16S rDNA序列，得到1 511 bp序列，利用GeneBank中BLAST與相關(guān)序列進(jìn)行相似性分析。結(jié)果表明，該分離株與諾卡菌屬的菌株親緣關(guān)系較近，與鰤魚諾卡菌NocardiaseriolaeJCM3360T的16S rDNA基因序列相似性達(dá)99.9％，僅有2個堿基的差異。

諾卡菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)顯示：菌株NH090627與鰤魚諾卡菌NocardiaseriolaeJCM3360T聚為一個分支，與其他細(xì)菌均相距較遠(yuǎn)，據(jù)此鑒定該菌株為鰤魚諾卡菌Nocardiaseriolae。

表1 菌株NH090627和參照菌株的生理生化特征

表2 菌株NH090627感染健康加州鱸試驗(yàn)結(jié)果

圖5 基于16S rRNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖中所用各菌株16S rDNA序列號分別為：Nocardiaseriolae(DQ659915),Nocardiaotitidis-caviarum(DQ659912),Nocardiacrassostrae(Z37989),Nocardianova.( Z36930),Nocardiavaccinii(Z36927),Nocardiapseudobrasiliensis(X84857),Nocardiabrevicatena(Z36928),Nocardiacarnea(Z36929),Nocardiaflavorozea(Z46754),Nocardiatransvalensis(Z36926),Nocardiabrasiliensis(Z36935),Nocardiafarcinica(Z36936),Nocardiaasteroids(Z36934),Nocardiasalmonicida(Z46750)

2.6 藥物敏感試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明該株鰤魚諾卡菌對氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素等敏感，但對磺胺類和氨芐青霉素有耐藥性(表3)。

表3 菌株NH090627藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

諾卡菌廣泛分布在水、土壤及活性污泥中，是人和動物的機(jī)會致病菌。 能引起水產(chǎn)動物疾病的諾卡菌包括鰤魚諾卡菌Nocardiaseriolae[5,7]、殺鮭諾卡菌Nocardiasalmonicida[6]、星狀諾卡菌Nocardiaasteroids[8]、粗形諾卡菌Nocardiacrassostreae[9]。鰤魚諾卡菌最早于1968年分離自日本養(yǎng)殖五條鰤Seriolaquinqueradiata，它是目前報道最多的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)殖魚類的病原菌。據(jù)國外報道，該病原菌能感染多種養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，如五條螄Seriolaquinqueradiata、加州鱸Micropterussalmoides、海鱸Lateolabraxjaponicus、紅鰭笛鯛Lutjanuserythropterus等[10-11]。盡管如此，國內(nèi)有關(guān)養(yǎng)殖魚類諾卡菌感染報道的還比較少，而且目前尚未見有關(guān)加州鱸諾卡病的系統(tǒng)分析報道。本文首次從患病加州鱸體內(nèi)分離鑒定了病原菌，確定了引起加州鱸結(jié)節(jié)病的病原菌為鰤魚諾卡菌。

通過對佛山、南海加州鱸養(yǎng)殖場的患病魚解剖觀察，我們發(fā)現(xiàn)其癥狀與以往報道的魚類諾卡菌病十分相似，體表和內(nèi)臟器官出現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)狀肉芽腫，腎臟尤為明顯。腎臟組織切片能觀察到明顯的肉芽腫狀結(jié)構(gòu)，中央為壞死的組織殘骸，被大量巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞包圍[5]。分離病原菌的形態(tài)、生長特性和生理生化特征與諾卡菌屬相符，硝酸鹽還原活性與國內(nèi)報道的鰤魚諾卡菌分離株一致，均為陽性[12-14]，但是與分離自日本五條鰤的標(biāo)準(zhǔn)株Nocardiaseriolae JCM3360T不同[4]。為確定該菌株的分類地位，我們對其進(jìn)行了16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看到，該菌株與Nocardiaseriolae JCM3360T聚為一個分支，由此可以確定該菌株為鰤魚諾卡菌Nocardiaseriolae。

為了進(jìn)一步證實(shí)所分離的鰤魚諾卡菌為加州鱸結(jié)節(jié)病的致病菌，我們進(jìn)行了動物回歸感染試驗(yàn)。結(jié)果表明該分離菌株對加州鱸具有很強(qiáng)的致病性，經(jīng)2.5×107cfu/mL劑量腹腔注射感染的健康加州鱸全部死亡，而對照組未見死亡。同時，我們從感染魚體內(nèi)分離到形態(tài)和生化特征與從自然發(fā)病魚體分離菌株完全一致的細(xì)菌，說明該菌是引起自然發(fā)病魚死亡的病原菌。回歸試驗(yàn)中發(fā)病魚的內(nèi)臟腫脹，并出現(xiàn)白灰色壞死病灶，但無明顯的結(jié)節(jié)出現(xiàn)。究其原因可能是人工腹腔感染較為劇烈，試驗(yàn)魚體對大量的病原菌反應(yīng)強(qiáng)烈，因而呈現(xiàn)出腫脹、壞死病灶等急性炎癥反應(yīng)，自然感染條件下感染細(xì)菌數(shù)量較少，病程較長，因此出現(xiàn)慢性漸進(jìn)病癥。

為了指導(dǎo)養(yǎng)殖中該病的防控，本文還對該病原菌的藥物敏感性進(jìn)行了初步研究，紙片擴(kuò)散法結(jié)果顯示其對大多數(shù)試驗(yàn)藥物均敏感，其中對氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素敏感性最強(qiáng)，而對磺胺類和氨芐青霉素則有耐藥性，與暗紋東方鲀和卵形鯧鲹分離株耐藥性基本一致[12-13]。本試驗(yàn)的結(jié)果能夠?yàn)榧又蓣|魳魚諾卡菌的藥物防治提供一定的參考依據(jù)，在疾病高發(fā)季節(jié)，可以合理的使用部分藥物進(jìn)行預(yù)防。

魚類諾卡菌病是一種全身性的慢性傳染病，該病病情不劇烈，發(fā)病早期癥狀不明顯，但持續(xù)時間長，一旦感染累積死亡率較高。2003年我國首次在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中發(fā)現(xiàn)諾卡菌病[14]，近幾年逐漸有蔓延和傳染其他魚類的趨勢，該菌在廣東地區(qū)養(yǎng)殖的烏鱧、卵形鯧鲹、紫紅笛鯛上也多次被檢出。因此，盡快開展流行病學(xué)調(diào)查，探究不同菌株之間的血清型和基因型關(guān)系，建立快速診斷方法，對于諾卡菌病的早期防治，避免其繼續(xù)蔓延和傳播，是非常必要的。

參考文獻(xiàn)：

[1]LECHEVA1IER H A.Nocardioform Actinomycetes[C]//Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Vol.4.Baltimore:The Williams and Wi1kins Co,1989：2348- 2404.

[2]劉志恒,姜成林.放線菌現(xiàn)代生物學(xué)與生物技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[3]EDWARDS U,ROGALL T,BL?CKER H,et al.Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes.Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA[J].Nucleic Acids Res,1989,17(19): 7843-7853.

[4]KUDO T,HATAI K,SEINO A.Nocardiaseriolaesp.nov.causing nocardiosis of cultured fish[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1988,38: 173-178.

[5]CHEN S C,LEE J L,LAI C C,et a1.Nocardiosis in sea bass,Lateolabraxjaponicus,in Taiwan [J].Joural of Fish Disseases,2000,23(5): 299-307.

[6]ISIK K,CHUN J,HAH Y C,et a1.Nocardiasalmonicidanom.rev.,a fish pathogen[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1998,49: 833-837.

[7]KUSUDA R,TAKI H,TAKEUEHI T.Studies on a nocardial infection of culture yellow tail Ⅱ.Characteristics ofNocardiakampachiisolated from a gil1-tuberculosis of yellow tail[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries,1974,10: 369-373．

[8]CHEN S C,TUNG M C.A epizootie in large mouth bass,Micropterussalmoides,Lacepede caused byNocardiaasteroidesin freshwater pond in southern Taiwan[J].Journal of Chinese Society of Veterinary Science,1991,17: 15-22.

[9]FRIEDMAN C S,BEAMAN B L,CHUN J,et a1.Nocardiacrassostreaesp.nov.,the causal agent of nocardiosis in Pacific oysters[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1998,48: 237-246．

[10]SHIMAHARA Y,NAKAMURA A,NOMOTO R,et al.Genetic and phenotypic comparison ofNocardiaseriolae,isolated from fish in Japan[J].Journal of Fish Diseases,2008,31: 481-488.

[11]SHIMAHARA Y,HUANG Y F,TSAI M A,et al.Genotypic and phenotypic analysis of fish pathogen,Nocardiaseriolae,isolated in Taiwan[J].Aquaculture,2009,294: 165-171.

[12]彭開松,佘銳萍,祁克宗,等.暗紋東方鲀脂肪肝并發(fā)諾卡氏菌病[J]．水產(chǎn)科學(xué)，2008， 27 (12)：629-632.

[13]王瑞旋,劉廣鋒,王江勇,等.養(yǎng)殖卵形鯧鲹諾卡氏菌病的研究[J]．海洋湖沼通報，2010，1：52-58

[14]王國良,袁思平,金珊.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚諾卡氏菌病的初步研究[J]．水產(chǎn)學(xué)報，2006，30 (1)：103-107.