摘要：文章采用大腸桿菌和水稻白葉枯病菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，研究了其在不同的超聲時(shí)間，不同的破壁方法，不同的酶作用下DNA提取的效果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)、優(yōu)化，得出一種準(zhǔn)確、高效的DNA提取方法。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌DNA提??；紫外分光光度計(jì)；大腸桿菌；水稻白葉枯病菌

中圖分類號(hào)：Q782 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-2374（2012）01-0041-03

本文選用了大腸桿菌和水稻白葉枯病菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，將培養(yǎng)一定時(shí)間的菌種所提取的DNA，在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)首先研究超聲時(shí)間對(duì)大腸桿菌DNA提取效果的影響，其次在傳統(tǒng)法、水煮法、ES法（傳統(tǒng)法+溶菌酶）、ESU法（傳統(tǒng)法+超聲+溶菌酶）之間進(jìn)行比較，分析不同提取方法提取的兩種菌株DNA的濃度及純度，找出了一種準(zhǔn)確、高效的DNA提取方法，為今后生物檢測(cè)鑒定工作提供了保障。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌：革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×（1～3）μm。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽胞，是人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，主要寄生在大腸內(nèi)。

水稻白葉枯病菌：革蘭氏陰性菌，由水稻黃單胞細(xì)菌水稻致病變種侵染引起的嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)的一種植物細(xì)菌。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1．細(xì)菌的培養(yǎng)。根據(jù)兩種細(xì)菌不同的生長(zhǎng)條件制備相應(yīng)的培養(yǎng)基，具體如下：

水稻白葉枯病菌：（NA培養(yǎng)基）牛肉浸膏3g，蛋白胨7.5g，蔗糖10g，加蒸餾水至1000mL，調(diào)至pH7.0，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂。

大腸桿菌：（LB培養(yǎng)基）細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，加蒸餾水至1000mL，調(diào)至pH 7.0，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂。

大腸桿菌培養(yǎng)基放置于37℃的搖床上培養(yǎng)12h，水稻白葉枯病菌培養(yǎng)基放置于28℃的搖床上培養(yǎng)48h，由液體培養(yǎng)基的渾濁度來(lái)判斷細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

2．細(xì)菌DNA的提取。

（1）傳統(tǒng)提取法。

步驟一：取3mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液于離心管中，離心1min，棄上清液，收集菌體；

步驟二：加800μL裂解緩沖液（40mM Tris-醋酸，pH 7.8的20mM 醋酸鈉，1mM EDTA，10% SDS），吹打混勻（槍頭去尖）；

步驟三：加400μL 5M NaCl混勻后，離心12min（時(shí)間不能少）；

步驟四：將上清液移至另一離心管中，加入10 μL RnaseA（10mg/mL）37℃溫浴30min；

步驟五：加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25︰24︰1）抽提，充分混勻抽提；

步驟六：離心8 min收集上清，用氯仿抽提一次，離心8 min后吸取上清至新的離心管內(nèi)；

步驟七：加2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA后離心8 min，用70％乙醇洗滌沉淀2次。

步驟八：干燥后，溶于100 μLTE中于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）水煮提取法。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液3 mL加入到離心管中離心1 min，棄上清；沉淀加入1.2 mL無(wú)菌去離子水，振蕩混勻，100℃水浴10 min后離心5 min，上清即為DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）超聲時(shí)間對(duì)DNA提取效果的影響。在傳統(tǒng)提取法步驟二后使用超聲波（功率400 W）超聲1、3、5和7 min，其他步驟同傳統(tǒng)法。

（4）溶菌酶對(duì)細(xì)菌DNA提取效果的影響。在傳統(tǒng)提取法步驟一之后加入20μL50 mg/mL的溶菌酶，37℃溫育30 min（不斷振蕩），其他步驟同傳統(tǒng)法。

（5）超聲、溶菌酶雙重效應(yīng)對(duì)DNA提取效果的影響。在傳統(tǒng)提取法步驟一之后加入20 μL 50 mg/mL溶菌酶，37℃溫育30min（不斷振蕩），步驟二之后超聲（功率400W）3 min，其他步驟同傳統(tǒng)法。

3．DNA濃度/純度測(cè)定。Agilent 8453紫外分光光度計(jì)開(kāi)機(jī)、開(kāi)燈預(yù)熱30min；用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關(guān)上蓋板；設(shè)定狹縫后校零。將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（DNA15 μL用TE緩沖液稀釋至3000 μL）后，記錄編號(hào)和稀釋度。把裝有標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品的比色皿放進(jìn)樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板；設(shè)定測(cè)定的紫外光波長(zhǎng)，測(cè)定260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值及OD260/OD280的比值；計(jì)算待測(cè)樣品的濃度（μg/μL）=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000。

二、結(jié)果分析與討論

（一）超聲時(shí)間對(duì)大腸桿菌DNA提取效果的影響

實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過(guò)12h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，利用傳統(tǒng)提取法、傳統(tǒng)法結(jié)合超聲處理1min、3min、5min、7min的方法提取DNA，每種方法所用大腸桿菌菌液量均為3mL，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、表1所示：

由表1可知，提取的DNA濃度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這主要是因?yàn)槌暿辜?xì)菌細(xì)胞壁更容易破裂，從而裂解液中SDS能更充分地破壞細(xì)胞膜及核膜的結(jié)構(gòu)，使DNA迅速釋放出來(lái)。

在超聲過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，以超聲3min破碎細(xì)菌提取的DNA OD260/OD280最接近比值1.8，DNA的純度較高，超聲波處理的時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，最佳破壁時(shí)間為3min。

（二）傳統(tǒng)法與水煮法的比較

實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過(guò)12h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的大腸桿菌和48 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的水稻白葉枯病菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，比較傳統(tǒng)提取法與水煮法提取的DNA濃度與純度。所用菌液量均為3mL，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA測(cè)定3次，最后結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、表2、表3所示：

由表2、3可知，水煮法得到的DNA濃度比傳統(tǒng)法要高，主要因?yàn)樗蠓ú襟E簡(jiǎn)潔，減少了操作過(guò)程中對(duì)DNA的損失及外源DNA污染機(jī)會(huì)。水煮法提取過(guò)程中不需要酚—氯仿抽提及乙醇沉淀，避免了對(duì)人體的危害，且所需費(fèi)用低，但水煮法提取的DNA純度較傳統(tǒng)法有小幅下降，主要是因?yàn)槌樘徇^(guò)程簡(jiǎn)單，DNA溶液中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)無(wú)法完全去除。水煮法適用于對(duì)DNA純度要求不高的PCR、RAPD等實(shí)驗(yàn)，因高溫使DNA變性，該法不適于限制性內(nèi)切酶酶切分析。傳統(tǒng)法所需費(fèi)用低，但操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，DNA損失量大，產(chǎn)率低，且有污染和毒性作用。

（三）溶菌酶對(duì)DNA提取效果的影響

圖3 ES法提取的兩種菌種DNA紫外吸收?qǐng)D譜

實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過(guò)12 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的大腸桿菌和48 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的水稻白葉枯病菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，比較傳統(tǒng)提取法與ES法提取的DNA濃度與純度。菌液量為3mL，用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，結(jié)果如圖3、表4、表5所示：

由表4、表5可知，加入溶菌酶后提取的DNA濃度有明顯的提高，而純度變化不是很大。ES法在提取DNA過(guò)程中，使用溶菌酶破壁后的菌液黏稠，不易脫蛋白，DNA黏度大，純度低，DNA被蛋白質(zhì)纏繞難以舒展變性，對(duì)變性過(guò)程中相對(duì)吸光度增長(zhǎng)幅度略有阻礙。

（四）超聲、溶菌酶雙重效應(yīng)對(duì)DNA提取效果的影響

實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)過(guò)12 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的大腸桿菌和48 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)的水稻白葉枯病菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，比較傳統(tǒng)提取法與ESU法提取的DNA濃度與純度，所用菌液量為3 mL，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA測(cè)定3次，最后結(jié)果取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、表6、表7所示，傳統(tǒng)法、ES法紫外吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖2、圖3所示：

由表6、表7可知，ESU提取的DNA濃度及純度較傳統(tǒng)法、ES法有很大的提高，效果十分明顯。ESU法在DNA提取過(guò)程中，溶菌酶、SDS和超聲波三者聯(lián)合作用使細(xì)菌破壁更充分，DNA回收量大，純度高，ESU法在超聲前加入溶菌酶，溶菌酶破壁后黏稠的菌液緩沖了單純使用超聲波對(duì)DNA造成直接破壞，使提取的DNA片段大小適中，濃度較高。

三、結(jié)論

1．DNA濃度及純度可以通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)出來(lái)，速度快，準(zhǔn)確度高，影響因素少。

2．DNA濃度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而超聲時(shí)間為3min的時(shí)候檢測(cè)出來(lái)的DNA純度最好，所以超聲最佳時(shí)間為3min。

3．溶菌酶的合理使用能增加提取DNA的濃度。

4．ESU法提取的DNA無(wú)論是濃度還是純度都比較理想，是一種值得推廣的提取DNA方法，主要針對(duì)于對(duì)DNA濃度/純度要求高的實(shí)驗(yàn)。

5．水煮法所需費(fèi)用低，步驟簡(jiǎn)潔，耗時(shí)短，減少了DNA損失及外源DNA的污染機(jī)會(huì)，不需要酚－氯仿抽提及乙醇沉淀，避免了有機(jī)溶劑對(duì)人體的危害，但提取的DNA濃度一般，純度不高，適用于對(duì)DNA純度要求不高的PCR、RAPD等實(shí)驗(yàn)。

四、結(jié)語(yǔ)

紫外分光光度法檢測(cè)DNA濃度、純度是一種快速、有效的定量方法，可以根據(jù)待測(cè)物質(zhì)在紫外區(qū)的吸收性質(zhì)，來(lái)精確測(cè)定其DNA濃度/純度，為分子生物學(xué)的發(fā)展及DNA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提供了方便。

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作者簡(jiǎn)介：董艷磊，男，內(nèi)蒙古赤峰人，供職于中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)學(xué)院。

（責(zé)任編輯：陳 倩）