程水源 袁紅慧 程華 李琳玲 王燕 許鋒 姜德志

摘要：試驗以湖北省羅田縣的１５個板栗主要栽培品種為材料，利用ＩＳＳＲ分子標記對１５個板栗品種進行初步認證及親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，從３５條ＩＳＳＲ引物中篩選出１７條能夠擴增出清晰、穩(wěn)定條帶的引物；１７條引物共擴增出３９２條帶，其中多態(tài)性條帶有３４４條，多態(tài)性條帶比率為８７．８％。應(yīng)用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件進行ＵＰＧＭＡ法聚類分析，１５個板栗品種大致被分為三類。其中普通八月紅和特殊八月紅基本無遺傳差異，玫瑰紅與烏殼栗，六月暴和桂花香親緣關(guān)系較近。初步鑒定結(jié)果可為板栗品種鑒別、分類及種質(zhì)資源的有效利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：羅田板栗；ＩＳＳＲ標記；品種鑒定

中圖分類號：Ｓ６６４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）14－3096-05

Ａ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｌｕｏｔｉａｎ Ｃｈｅｓｔｎｕｔ bｙ

ＩＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ

ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ－ｙｕａｎ１，２，ＹＵＡＮ Ｈｏｎｇ－ｈｕｉ１，２，ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ１，２，ＬＩ Ｌｉｎ－ｌｉｎｇ１，２，ＷＡＮＧ Ｙａｎ１，ＸＵ Ｆｅｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，２

（１． Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Sｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ １５ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｕｏｔｉａｎ ｃｏｕｎｔｙ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ （ＩＳＳＲ） ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １７ ｐｒｏｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｒｉｃｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３５ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅｓｅ １７ ｐｒｉｍｅｒｓ， a total of 392 bands were amplified from ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡｓ ｏｆ ｔｈｅ １５ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， among ｗｈｉｃｈ ３４４ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｎｄｓ， with a ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ of ８７．８％． １５ Ｌｕｏｔｉａｎ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ｂｙ ＵＰＧＭＡ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｎｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ Bａｙｕｅｈｏｎｇ ａｎｄ ｓｐｅｃｉａｌ Bａｙｕｅｈｏｎｇ， ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Mｅｉｇｕｉｈｏｎｇ ａｎｄ Wｕｋｅｌｉ， Lｉｕｙｕｅｂａｏ ａｎｄ Gｕｉｈｕａｘｉａｎｇ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ． Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｕｏｔｉａｎ cｈｅｓｔｎｕｔ； ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ； ｖａｒｉｅｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ Ｂｌｕｍｅ）俗稱栗子，又名瑰栗、毛栗、風(fēng)栗，是殼斗科栗屬的植物，落葉喬木。我國板栗栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，在復(fù)雜的地理條件和氣候條件下，形成許多生態(tài)類型和地方品種［1］，河北、山東、湖北（羅田、麻城、大悟）、河南羅山、陜南鎮(zhèn)安等地均是板栗著名的產(chǎn)區(qū)，其中尤以湖北羅田板栗最為著稱。羅田栽培板栗品種多樣，其中玫瑰紅、淺刺大板栗、六月暴、烏殼栗、白毛早、紅毛早、青毛早等品種栽培甚為廣泛，對這些品種的劃分傳統(tǒng)方法主要依據(jù)板栗的形態(tài)特征、生物學(xué)特性等來鑒別，但在實際生產(chǎn)中對形態(tài)相似的品種僅依靠形態(tài)特征難以在苗木期就準確鑒別，且木本植物結(jié)實周期長，因而不利于優(yōu)良品種的生產(chǎn)、推廣和種質(zhì)資源保存。如何準確鑒別品種，及時對新品種予以審定、注冊、保護，建立準確可靠的品種特異性檢測方法，對提高板栗的經(jīng)濟效益具有非常重要的實際價值［2］。

ＩＳＳＲ標記是近幾年在微衛(wèi)星分子標記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分子標記技術(shù)［3］，與其他分子標記如ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰｓ、ＳＳＲｓ、ＲＡＰＤ相比，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡便、費用低等優(yōu)點。ＩＳＳＲ標記能有效揭示種群內(nèi)的遺傳多樣性，進而分析其系統(tǒng)分化規(guī)律，研究群體遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性程度［4］。因此，ＩＳＳＲ標記技術(shù)在園藝植物種質(zhì)資源研究、遺傳關(guān)系分析、變異品種鑒定等方面具有廣泛應(yīng)用［5－9］。

目前，ＩＳＳＲ分子標記在板栗中的應(yīng)用研究報道并不多見，僅見艾呈祥等［１0］采用ＩＳＳＲ分子標記對山東省內(nèi)１０個板栗居群的２９７個個體的遺傳多樣性水平及居群遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究；韓繼成等［１1］通過優(yōu)化的ＩＳＳＲ反應(yīng)體系對河北省板栗生態(tài)型進行分析，以確定河北省板栗居群的遺傳多樣性。

本研究選用ＩＳＳＲ技術(shù)來探討羅田板栗種質(zhì)資源概況，以期能夠更快速、準確、方便地獲得板栗種質(zhì)資源的遺傳信息，從分子水平上為板栗種質(zhì)資源的豐富和發(fā)展提供參考依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１植物材料試驗材料為湖北省羅田縣板栗產(chǎn)區(qū)的１５個栽培品種，每個品種隨機選?。保啊玻捌啄廴~片裝入做好標記的袋中，于－４０ ℃冰箱中冷凍保存。材料來源和編號見表１。

１．１．２主要試劑瓊脂糖、５×ＴＢＥ緩沖液、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ購自北京天根生化科技有限公司；Ｍａｋｅｒ ＤＬ ２０００購自寶生物工程（大連）有限公司；ＣＴＡＢ ＤＮＡ提取試劑盒、３０％聚丙烯酰胺、過硫酸胺、ＴＥＭＥＤ、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸等，購自武漢貝爾生物技術(shù)有限公司。

１．２試驗方法

１．２．１板栗基因組ＤＮＡ的提取與檢測本試驗參考魏春紅［１2］、程麗莉等［１3］的ＣＴＡＢ提取法略作改進，提?。保祩€板栗品種葉片的總基因組ＤＮＡ。０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的ＤＮＡ質(zhì)量，紫外分光光度計檢測ＤＮＡ濃度，提取的總ＤＮＡ于－２０ ℃保存，備用。

１．２．２引物來源及ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增反應(yīng)體系的建立試驗所用引物是依據(jù)板栗ＥＳＴ文庫，篩選出ＳＳＲ序列，參照加拿大哥倫比亞大學(xué)網(wǎng)站公布的ＩＳＳＲ引物序列，共設(shè)計出３５條擴增引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增反應(yīng)體系為３０ μＬ： ２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ反應(yīng)液（０．１ Ｕ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／μＬ、５００ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ 及穩(wěn)定劑和增強劑）１５ μＬ，引物３ μＬ，ＤＮＡ模板５０ ｎｇ，ｄｄＨ２Ｏ ９ μＬ。反應(yīng)程序設(shè)為：９４ ℃預(yù)變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，４１～５５ ℃退火４０ ｓ（具體參考表２），７２ ℃ ３ ｍｉｎ，共３５個循環(huán)； ７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。

１．２．３引物篩選選用基因組ＤＮＡ純度較高的板栗樣品為模板，分別對３５個引物采用以上擴增程序進行ＰＣＲ擴增。擴增產(chǎn)物先用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，再用６％的聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步分析，篩選出多態(tài)性較高的引物用于１５個板栗樣品的鑒定。

１．２．４數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析將選擴的ＰＣＲ產(chǎn)物用６％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在９０Ｖ電壓下電泳約５０ ｍｉｎ，經(jīng)硝酸銀染色，氫氧化鈉顯影，所獲得的擴增條帶以０、１統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫。條帶統(tǒng)計以其清晰可重復(fù)為基本原則，采用人工讀帶法，在相同遷移位置，有帶記為１，無帶記為０。在ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ分析軟件中，根據(jù)ＳＭ相似系數(shù)法求得品種間的遺傳相似性矩陣，再用ＵＰＧＭＡ進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［１4］。

２結(jié)果與分析

２．１引物篩選結(jié)果

隨機選取普通八月紅、北豐羊毛栗２個品種的ＤＮＡ為模板，分別對３５條ＩＳＳＲ擴增引物進行篩選，淘汰無擴增產(chǎn)物和多態(tài)性差的引物，選留擴增條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的引物。根據(jù)0.8%的瓊脂糖電泳得到的初步檢測結(jié)果（圖１），結(jié)合6%的聚丙烯酰胺電泳（圖２）的進一步分析，從中篩選出了１７個引物（表２）。這些引物均能在供試板栗中擴增出清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶。

圖１結(jié)果顯示，在泳道１～７、９～１２、１４～１７、２４～２６、３１、３３～３５中均有多態(tài)性條帶，說明對應(yīng)編號的引物都可為ＩＳＳＲ引物篩選提供參考。對其他泳道沒有顯示多態(tài)性條帶的引物予以淘汰。

由圖２聚丙烯酰胺電泳檢測結(jié)果分析知，泳道１～７、１０～１２、１５～１７、２４～２６、３１、３３、３４多態(tài)性條帶數(shù)清晰且條帶數(shù)均在６條以上，再結(jié)合圖１初步篩選的結(jié)果確定了以下１７條引物（表２）用于羅田１５個板栗栽培品種的認證和鑒定。

２．２ＩＳＳＲ多態(tài)性分析及指紋分析

用篩選出的１７個引物分別對１５個羅田板栗栽培品種ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增，經(jīng)統(tǒng)計共擴增出３９２條ＤＮＡ帶，其中多態(tài)性條帶３４４條，平均每個引物擴增出２３．１條帶，平均多態(tài)性位點百分率為８７．８％，具體擴增結(jié)果見表２。不同引物擴增出的條帶數(shù)有較大差異，引物Ｌ１２、Ｌ１擴增出的條帶較多，分別為３１、３０條；引物Ｌ２４擴增出的條帶數(shù)最少，為１２條。引物多態(tài)性達９０％以上的有Ｌ１、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ１１、Ｌ１７、Ｌ２４、Ｌ３３共７個，其中引物Ｌ２的多態(tài)性最高，為１００％。１７條引物分別建立了相應(yīng)的ＤＮＡ指紋圖譜，由各引物擴增效果所反應(yīng)出的ＤＮＡ條帶多態(tài)性，能較好地區(qū)分開各板栗品種。

２．３板栗品種間的遺傳相似性分析

用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件計算板栗品種間的Ｄｉｃｅ遺傳相似系數(shù)（見表３）。由表３可知，１５個板栗品種間的遺傳相似系數(shù)范圍為０．５３～０．９７，平均遺傳相似性系數(shù)為０．６７。結(jié)果顯示普通八月紅與特殊八月紅遺傳相似性系數(shù)最大，為０．９７，說明這兩個品種親緣關(guān)系很近，有可能為同一品種。其次是玫瑰紅與烏殼栗、六月暴與桂花香，相似性系數(shù)分別為０．８９、０．８７，表明它們之間的親緣關(guān)系很接近，遺傳差異較小。而普通八月紅與處暑紅、白毛早與特殊八月紅、特殊八月紅與處暑紅之間均具有最小遺傳相似性系數(shù)，為０．５３，可見它們遺傳差異比較大，兩兩品種間的親緣關(guān)系較遠。

２．４聚類分析

在獲得兩兩不同品種間的Ｄｉｃｅ遺傳相似系數(shù)基礎(chǔ)上，以３４４個位點的譜帶為原矩陣，采用ＵＰＧＭＡ法構(gòu)建了15個板栗品種間的系統(tǒng)進化樹（圖３）。樹狀圖與品種間的遺傳相似系數(shù)反應(yīng)的情況基本一致，即遺傳相似系數(shù)越高，親緣關(guān)系越近，品種間差異就越小。從圖3可以看出，在相似性系數(shù)０．５９處，１５個品種資源劃分成Ａ、Ｂ兩支，Ｂ群由白毛早和處暑紅構(gòu)成，兩品種間的相似系數(shù)為０．６５。其余１３個品種聚為Ａ群，在相似系數(shù)０．６５處Ａ群分為Ａ１和Ａ２兩個亞群。Ａ１亞群包括普通八月紅、特殊八月紅、勝利羊毛栗早熟、淺刺大板栗和中果早栗，在遺傳相似系數(shù)０．６９處，５個品種又被聚為兩個小類群，前３個為一個小類群，其中以普通八月紅與特殊八月紅相似性系數(shù)最高，而勝利羊毛栗早熟也可與它們歸為一類，從１５個品種的１７個ＩＳＳＲ指紋圖譜中也可以明顯看出，這３個品種的指紋圖譜非常接近。淺刺大板栗和中果早栗則聚為第二個小類群，兩者的遺傳相似系數(shù)為０．７８。