陳亞

摘要：以地產(chǎn)克氏螯蝦（Procambarus clarkii）蝦殼為原料，采用乳酸菌（Lactococcus lactis）發(fā)酵的方法提取甲殼素，并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，發(fā)酵的最佳工藝組合為發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間96 h，葡萄糖加入量5%，固液比1.0∶3.0（m/V，g∶mL），發(fā)酵起始pH 5.5。采用上述組合，所得甲殼素產(chǎn)率達(dá)13.9%。該工藝具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：甲殼素；制備；乳酸菌（Lactococcus lactis）發(fā)酵；克氏螯蝦（Procambarus clarkii）蝦殼

中圖分類號(hào)：Q815文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2012）20-4607-03

甲殼素（Chitin）又名幾丁質(zhì)、殼多糖、甲殼質(zhì)、聚乙酰氨基葡萄糖等，化學(xué)名稱為（1，4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，分子式為（C8H13NO5）n，它是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接的一種乙酰氨基葡萄糖。甲殼素是人類繼發(fā)現(xiàn)淀粉、纖維素之后在地球上發(fā)現(xiàn)的第三大生物資源，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等動(dòng)物的外殼及植物的細(xì)胞壁中，是一種重要的天然高分子多糖。在甲殼素被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，人們對(duì)該類化合物進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究，揭示了其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、日化、輕紡、環(huán)保等領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1-3]。

目前，國(guó)內(nèi)外主要采用傳統(tǒng)的化學(xué)方法生產(chǎn)甲殼素，生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，但生產(chǎn)過(guò)程中大量使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時(shí)造成水資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。可以說(shuō)，高污染及浪費(fèi)水資源已成為影響甲殼素產(chǎn)業(yè)生存與發(fā)展的瓶頸，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。而采用生物工藝，即通過(guò)微生物的發(fā)酵作用代替化學(xué)工藝制備甲殼素，正成為甲殼素生產(chǎn)工藝研究的熱點(diǎn)[4，5]。

本研究以地產(chǎn)克氏螯蝦（Procambarus clarkii）（俗稱小龍蝦）蝦殼為原料，采用乳酸菌（Lactococcus lactis）純種發(fā)酵的方法制備甲殼素，以期為甲殼素這一重要生物資源的更好利用以及中國(guó)甲殼素生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)革新提供新的有效途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料選新鮮、雜質(zhì)少、無(wú)霉變腐爛和蟲蛀現(xiàn)象的地產(chǎn)克氏螯蝦蝦殼為原料。

1.1.2菌株菌株為鹽城師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保藏的乳酸菌種。

1.1.3培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO4 2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 0.1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，用去離子水定容至1 000 mL；脫脂乳培養(yǎng)基為市售鮮牛乳。

1.1.4主要儀器KYC-100C空氣恒溫?fù)u床購(gòu)自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，101-A電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司，F(xiàn)A1604電子天平購(gòu)自上海良平儀器儀表有限公司，PHS-3C型pH計(jì)購(gòu)自上海雷磁儀器廠。

1.2方法

1.2.1菌種的活化將保存的乳酸菌菌種用新鮮滅菌脫脂乳活化1代，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜至牛乳凝固，再以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，重復(fù)活化2～3代，直至菌種恢復(fù)活力，冷藏備用。

1.2.2發(fā)酵液的制備吸取活化的菌液以體積分?jǐn)?shù)為1.5%的接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)12 h至培養(yǎng)液渾濁，冷藏備用。

1.2.3原料的預(yù)處理地產(chǎn)克氏螯蝦蝦殼經(jīng)清洗和去除雜質(zhì)，于105 ℃干燥4 h，用絞肉機(jī)絞碎備用。

1.2.4發(fā)酵試驗(yàn)稱取經(jīng)預(yù)處理的地產(chǎn)克氏螯蝦蝦殼100 g，置于500 mL三角燒瓶中，加入葡萄糖、發(fā)酵液。將燒瓶置于空氣恒溫?fù)u床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為250 r/min，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾，用去離子水漂洗至中性，于105 ℃烘箱恒溫干燥4 h，即得到白色固態(tài)的甲殼素。根據(jù)影響發(fā)酵進(jìn)程的因素，以甲殼素產(chǎn)率為分析指標(biāo)，分別對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖加入量、固液比和發(fā)酵起始pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選單因素的最佳條件。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵溫度

溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量的重要因素之一[6]。發(fā)酵溫度不同，甲殼素產(chǎn)率亦明顯不同（表1）。

一般而言，菌體濃度與甲殼素產(chǎn)率成正相關(guān)。若發(fā)酵溫度過(guò)低，菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體濃度不高，從而影響甲殼素產(chǎn)率。若發(fā)酵溫度過(guò)高，菌體培養(yǎng)后期容易衰老而自溶，菌體濃度亦不高，也會(huì)影響甲殼素的提取。由表1可知，在一定范圍內(nèi)，甲殼素的產(chǎn)率隨發(fā)酵溫度的升高而增加，在37 ℃時(shí)達(dá)到最大，為13.7%，繼續(xù)提高發(fā)酵溫度，甲殼素產(chǎn)率反而下降，故選擇發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.2發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間對(duì)反應(yīng)進(jìn)行的程度、甲殼素的產(chǎn)率和質(zhì)量也有較大影響。由表2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，甲殼素產(chǎn)率隨之上升，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí)，甲殼素產(chǎn)率達(dá)13.8%。繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，甲殼素產(chǎn)率上升不明顯。故綜合考慮設(shè)備利用率、發(fā)酵成本等因素，選擇96 h作為較好的發(fā)酵時(shí)間。

2.3葡萄糖加入量

微生物生長(zhǎng)繁殖需要一定的碳源，而碳源的濃度對(duì)微生物發(fā)酵有明顯影響。碳源過(guò)于豐富，易引起菌體異常繁殖，對(duì)菌體代謝、產(chǎn)物合成及氧的傳遞不利；反之，如果僅僅供給維持量的碳源，則菌體的生長(zhǎng)和代謝均受到抑制。以葡萄糖作為乳酸菌發(fā)酵的碳源，其加入量與甲殼素產(chǎn)率的關(guān)系如表3。由表3可知，葡萄糖加入量為5%時(shí)，甲殼素產(chǎn)率最高，發(fā)酵效果最好。

2.4固液比

在發(fā)酵試驗(yàn)中，加入足量的發(fā)酵液將原料蝦殼完全浸沒(méi)，是原料發(fā)酵充分、提高甲殼素產(chǎn)率的前提。試驗(yàn)結(jié)果顯示，固液比（m/V，g∶mL，下同）為1.0∶3.0時(shí)，可將蝦殼表面浸沒(méi)。因此，研究時(shí)分別將固液比設(shè)定為1.0∶3.0、1.0∶3.5和1.0∶4.0，研究發(fā)現(xiàn)3種固液比下甲殼素產(chǎn)率無(wú)明顯變化，而發(fā)酵時(shí)固液比加大，發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)用水、發(fā)酵殘液的總量會(huì)隨之增大，造成成本增加和副產(chǎn)物深度回收的困難，因而選擇的最適固液比為1.0∶3.0。

2.5發(fā)酵起始pH

乳酸菌在酸性環(huán)境中具有較高的活力，采用乳酸菌發(fā)酵的方法提取甲殼素，起始pH對(duì)甲殼素產(chǎn)率有一定影響（表4）。由表4可知，pH 5.5時(shí)甲殼素產(chǎn)率最高，為13.9%，因此選擇pH 5.5為最佳的發(fā)酵起始pH。

2.6發(fā)酵工藝的優(yōu)化

采用上述優(yōu)化的發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間96 h、葡萄糖加入量5%、固液比1.0∶3.0、發(fā)酵起始pH 5.5，利用乳酸菌發(fā)酵的方法制備甲殼素，得到甲殼素產(chǎn)率為13.9%，產(chǎn)品質(zhì)量符合市售甲殼素的質(zhì)量指標(biāo)。

3小結(jié)與討論

甲殼素作為重要的生物資源，其生產(chǎn)原料主要來(lái)自于蝦、蟹殼等，蝦殼中甲殼素含量約為15%～20%[7，8]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們主要通過(guò)化學(xué)方法，即采取強(qiáng)酸、強(qiáng)堿處理的方法開展甲殼素提取工藝的研究與應(yīng)用，例如，鄭鐵生等[8]以地產(chǎn)龍蝦殼為原料，探討甲殼素提取和殼聚糖制備的方法，其甲殼素得率為14.8%。項(xiàng)東升等[9]以地產(chǎn)龍蝦殼為原料，對(duì)采用化學(xué)方法提取甲殼素的工藝進(jìn)行優(yōu)化，使甲殼素得率達(dá)到15.0%，并對(duì)甲殼素提取過(guò)程中產(chǎn)生的廢液的處理做了有益的嘗試，取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。而Rao等[10]分別以蝦頭和蝦殼為原料，采用乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵的方法提取甲殼素，甲殼素得率分別為4.5%和13.0%。

本研究以經(jīng)預(yù)處理的地產(chǎn)克氏螯蝦蝦殼為原料，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到優(yōu)化的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間96 h、葡萄糖加入量5%、固液比1.0∶3.0、發(fā)酵起始pH 5.5。該條件下所得甲殼素產(chǎn)率為13.9%，其質(zhì)量符合市售甲殼素的質(zhì)量指標(biāo)。雖然研究中甲殼素的產(chǎn)率略小于上述化學(xué)工藝的研究報(bào)道，但采用乳酸菌等微生物發(fā)酵的生物工藝提取、生產(chǎn)甲殼素，無(wú)需大量使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，反應(yīng)條件溫和，而且節(jié)約水資源，可以顯著降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。特別值得一提的是，蝦殼中除了含有豐富的甲殼素，還富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、脂肪和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，目前生產(chǎn)上在提取獲得甲殼素后，往往將這些有用物質(zhì)隨同生產(chǎn)廢渣廢液一起排放到環(huán)境中，既造成資源浪費(fèi)，又產(chǎn)生環(huán)境污染。而采用微生物發(fā)酵的方法提取甲殼素，可以最大限度地減少有害化學(xué)物質(zhì)的殘留，使甲殼中其他有用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的回收利用成為可能，有利于原料的綜合利用。

地產(chǎn)克氏螯蝦蝦殼是水產(chǎn)品加工的廢棄物，同時(shí)又是一種重要的動(dòng)物性再生資源。本研究以地產(chǎn)克氏螯蝦蝦殼為原料，采用乳酸菌發(fā)酵的方法制備甲殼素，證明通過(guò)乳酸菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉必富，丁瑜，樊星，等.孝感市場(chǎng)小龍蝦及提取甲殼素的重金屬含量分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（6）：1458-1460.

[2] 高維錫，于慧，耿越.甲殼素、殼聚糖免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤研究進(jìn)展[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，25（1）：147-150.

[3] 李曉英，高萬(wàn)強(qiáng). 甲殼素及其衍生物的免疫活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 重慶文理學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，27（5）：65-67.

[4] 周湘池，劉必謙，郭春蘋，等. 生物技術(shù)清潔生產(chǎn)替代高污染化學(xué)法制備甲殼素的研究與應(yīng)用[J].海洋與湖沼，2008，39（5）：517-522.

[5] OZHAN A，MURAT E. Cocultivation of Lactococcus lactis and Teredinobacter turnirae for biological chitin extraction from prawn waste[J]. Bioprocess Biosyst Eng，2010，33（3）：393-399.

[6] 劉慧，杜薇，張紅星.乳酸乳球菌乳酸亞種高產(chǎn)膽鹽水解酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].食品科學(xué)，2006，27（11）：322-326.

[7] 索一婷，曲琪環(huán)，于娟娟.殼聚糖的提取來(lái)源及方法研究[J].吉林農(nóng)業(yè)（學(xué)術(shù)版），2011（4）：343-344.

[8] 鄭鐵生，辛淮生，卞愛(ài)民，等.地產(chǎn)龍蝦殼甲殼素的提取和殼聚糖的制備[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（12）：1208-1209.

[9] 項(xiàng)東升，李紅梅.地產(chǎn)龍蝦殼提取甲殼素及其廢水的綜合利用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，27（2）：52-54.

[10] RAO M S，STEVENS W F. Chitin production by Lactobacillus fermentation of shrimp biowaste in a drum reactor and its chemical conversion to chitosan[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2005，80（9）：1080-1087.