潘葉挺　鄒堅(jiān)定　龔梁　陳建強(qiáng)

[摘要] 目的 通過研究兔聲帶損傷后不同時(shí)期的組織病理學(xué)改變、上皮增殖活性及主要細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的變化，探討聲帶瘢痕形成機(jī)制。 方法 實(shí)驗(yàn)用兔聲帶銳性損傷后1周～6個(gè)月，通過HE染色、免疫組化染色、ELISA測(cè)定及Masson染色法，觀察聲帶組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化、上皮增殖活性及固有層內(nèi)透明質(zhì)酸、膠原纖維等主要ECM的分布及含量變化。 結(jié)果 兔聲帶損傷后3個(gè)月內(nèi)上皮增殖活性增強(qiáng)；6個(gè)月內(nèi)膠原纖維含量明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05）；透明質(zhì)酸增加不明顯。 結(jié)論 兔聲帶損傷后早、中期各種ECM分泌增加，主要表現(xiàn)為以膠原為主的纖維組織明顯增多且呈無序排列，透明質(zhì)酸增加不明顯；在損傷后期膠原持續(xù)高于正常，導(dǎo)致聲帶局部瘢痕形成。

[關(guān)鍵詞] 聲帶瘢痕；細(xì)胞外基質(zhì)；組織學(xué)

[中圖分類號(hào)] R739.65[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）29-0016-03

近年來，耳鼻咽喉外傷逐漸增多，聲帶損傷后瘢痕形成是永久性嗓音障礙的難治原因之一，嚴(yán)重者將出現(xiàn)喉腔粘連、狹窄，甚至引起呼吸困難，將嚴(yán)重影響患者的正常工作、社交和生活，但迄今尚無針對(duì)瘢痕本身的有效治療。這一問題長(zhǎng)期以來一直困擾著臨床醫(yī)生和患者。近些年來很多國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究將目光聚集于聲帶固有層內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）上，越來越多的研究表明，ECM的有序化排列是維持聲帶正常振動(dòng)的基礎(chǔ)，是干預(yù)聲帶疤痕形成的希望。聲帶損傷后ECM的組成和結(jié)構(gòu)改變，纖維組織的大量增生、無序沉積、局部攣縮，影響聲帶形態(tài)、振動(dòng)及聲門閉合，往往引起不可逆的變化[1，2]。我們從2011年1月開始，通過研究兔聲帶損傷后不同時(shí)期的組織病理學(xué)改變、上皮增殖活性及主要ECM（膠原纖維、透明質(zhì)酸）的變化特點(diǎn)，了解聲帶自身的修復(fù)特點(diǎn)，為聲帶損傷后選擇合理的治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

新西蘭白兔25只（上海醫(yī)科院，普通級(jí)），雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，創(chuàng)傷組20只，對(duì)照組5只。

1.2主要試劑

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Rapid Bio Lab，美國(guó)），小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（Santa Cruz，美國(guó)）。

1.3主要儀器及設(shè)備

小號(hào)支撐喉鏡（Karl Storz Gmb H，德國(guó)），喉刀。

1.4方法

1.4.1喉外傷的兔動(dòng)物模型的建立[3，4] 手術(shù)操作均由同一人完成。創(chuàng)傷組：新西蘭兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg行靜脈麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，以支撐喉鏡暴露聲門。用微型喉刀機(jī)械切劃聲帶前中部至聲韌帶，造成聲帶機(jī)械性損傷。左右側(cè)均同法處理。對(duì)照組：聲帶不作創(chuàng)傷處理。

1.4.2 術(shù)后檢測(cè)①HE染色：術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月、6月，分別在創(chuàng)傷組中隨機(jī)（采用隨機(jī)數(shù)字表法）抽取5只新西蘭兔處死，將喉取出，可獲得40份聲帶標(biāo)本，術(shù)后6個(gè)月后處死對(duì)照組5只新西蘭兔，獲得10份聲帶標(biāo)本。從手術(shù)損傷部位切取1 mm×1 mm×1 mm的聲帶黏膜組織，于4%甲醛中固定后，清水漂洗，石蠟包埋后切片，片厚4 μm，行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。②透明質(zhì)酸（HA）檢測(cè)：將各時(shí)間點(diǎn)所取50份聲帶標(biāo)本中手術(shù)損傷部位切取0.1 g的聲帶黏膜組織（重量由電子天平稱得）研磨成組織勻漿。用ELISA測(cè)定共計(jì)50份樣本中的透明質(zhì)酸（HA）含量。測(cè)定具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀上讀取吸光度（A）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)質(zhì)量濃度，結(jié)果以pg/mg表示。③上皮細(xì)胞增殖強(qiáng)度檢測(cè)：標(biāo)本切片后采用免疫組化法檢測(cè)聲帶黏膜上皮中的PCNA表達(dá)。具體步驟：組織石蠟切片，厚4 μm，60℃恒溫箱內(nèi)烤片1 h。二甲苯脫蠟和水化，酒精梯度脫二甲苯，蒸餾水清洗。微波法修復(fù)抗原，置于3% H2O2溶液中室溫下孵育30 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS液洗，滴加正常血清封閉液，37℃孵育10 min。滴加一抗PCNA抗體，4℃過夜，PBS清洗。滴加二抗（生物素化羊抗鼠抗體），37℃孵育20 min，PBS清洗。加鏈霉菌生物素—過氧化物酶溶液，37℃孵育20 min，PBS清洗。DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，片烤干，封片，光鏡下觀察。免疫組化檢測(cè)結(jié)果的觀察及判斷細(xì)胞計(jì)數(shù)：以細(xì)胞核呈彌漫棕黃色細(xì)小顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片上皮層隨機(jī)取8幅視野，采用全自動(dòng)圖像分析儀對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在400倍顯微鏡下記錄每視野（10 814 μm2）中的陽性細(xì)胞數(shù)。④膠原纖維沉積量的檢測(cè)：標(biāo)本切片后采用Masson染色法測(cè)聲帶黏膜下固有層中的膠原纖維沉積情況。具體步驟：10%甲醛液固定組織，石蠟切片，蘇木素染液5～10 min，1%鹽酸分化，流水沖洗數(shù)分鐘，Masson復(fù)合染色液5～10 min，1%磷鎢酸液處理約5 min，亮綠染色液（或苯胺藍(lán)液）復(fù)染5 min，1%冰醋酸水處理1 min，95%酒精、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。⑤膠原纖維定量分析：取Masson染色的組織切片，每張切片分別于固有層淺、中、深層各取3幅視野，采用德國(guó)KONTRON 131AS 2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠原纖維進(jìn)行定量分析，于200倍顯微鏡下分析其各自的面密度（目標(biāo)面積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積），統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積為44 783 μm2。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，創(chuàng)傷組術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別與對(duì)照組相比較，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

術(shù)后1個(gè)月的HE染色結(jié)果示：聲帶黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，外傷后創(chuàng)傷組觀察到上皮下固有層較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維增厚、增多，呈團(tuán)狀、漩渦狀，間質(zhì)水腫、變性。見圖1。

2.2 兩組間透明質(zhì)酸（HA）的比較

提示創(chuàng)傷后透明質(zhì)酸（HA）在1個(gè)月內(nèi)略增高，3個(gè)月后呈下降趨勢(shì)，但創(chuàng)傷組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別為t = 1.47、0.40、-0.15、-0.77，P = 0.159、0.697、0.886、0.453），詳見表1。

2.3上皮細(xì)胞增殖強(qiáng)度檢測(cè)

免疫組化染色示PCNA定位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核呈棕黃色反應(yīng)，胞漿和胞膜不著色。PCNA陽性細(xì)胞主要位于上皮基底層，提示創(chuàng)傷后上皮細(xì)胞增殖較活躍。創(chuàng)傷組1個(gè)月時(shí)上皮基底層PCNA著色明顯較對(duì)照組深（圖2），提示創(chuàng)傷后聲帶黏膜上皮增殖增強(qiáng)。創(chuàng)傷后1周及1個(gè)月時(shí)創(chuàng)傷組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（術(shù)后1周、1個(gè)月分別為t = 3.65、6.54，P = 0.002、0.000），創(chuàng)傷后3個(gè)月及6個(gè)月時(shí)創(chuàng)傷組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較雖略有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月分別為t = 1.69、0.56，P = 0.108、0.583），詳見表1。

2.4 膠原纖維觀察及定量分析

損傷1周后部分損傷聲帶出現(xiàn)纖維組織增生或膠原紊亂沉積，3個(gè)月后達(dá)到高峰，6個(gè)月時(shí)膠原纖維增生及沉積情況趨于穩(wěn)定，膠原含量在損傷后各時(shí)期均明顯高于正常對(duì)照組（術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別為t = 2.39、3.61、7.87、4.47，P = 0.028、0.002、0.000、0.000），詳見表1。Masson染色示組織中肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色?？梢妱?chuàng)傷組組織中大量膠原纖維增生，排列較紊亂，有的成團(tuán)或成束，有的扭曲纏繞。見圖3。

表1 各組透明質(zhì)酸（HA）、上皮細(xì)胞增殖強(qiáng)度、膠原纖維比較（x±s）

注：與對(duì)照組比較，*P > 0.05，**P < 0.05，***P < 0.01

3討論

聲帶固有層是介于聲帶上皮層與聲帶肌之間的結(jié)締組織，是與聲帶振動(dòng)密切相關(guān)的最重要的特征性結(jié)構(gòu)。根據(jù)分子類型，ECM成分可分為纖維蛋白、間隙蛋白及其他分子如碳水化合物、脂質(zhì)等。纖維蛋白包括彈性纖維和膠原纖維，其中彈性纖維賦予組織彈性，與聲帶變形和回復(fù)等聲帶振動(dòng)特性相關(guān)；膠原纖維為組織提供結(jié)構(gòu)和力量，受力時(shí)可承受壓力、抵抗變形。間隙蛋白圍繞在彈性成分周圍，包括透明質(zhì)酸和纖維連接蛋白。成纖維細(xì)胞則是分泌聲帶ECM的主要細(xì)胞。因此，本研究通過長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察兔聲帶損傷后不同時(shí)期的組織病理學(xué)改變、上皮增殖活性及主要ECM（膠原纖維、透明質(zhì)酸）的變化特點(diǎn)，以了解聲帶自身的修復(fù)特點(diǎn)。

聲帶創(chuàng)傷愈合中組織修復(fù)的特征是修復(fù)細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中我們采用PCNA免疫組化染色來衡量修復(fù)細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞的增殖活性與ECM成分的變化相吻合。在聲帶創(chuàng)傷后1個(gè)月內(nèi)，上皮細(xì)胞保持很活躍的增殖狀態(tài)，而此時(shí)主要ECM（膠原纖維、透明質(zhì)酸）的明顯增多，成正相關(guān)。相似的結(jié)果也見于Guqatschka M的研究[5]，其增殖活性可持續(xù)3個(gè)月左右。因此，本研究表明，ECM成分變化與聲帶創(chuàng)傷愈合過程中上皮細(xì)胞的增殖能力有關(guān)。

固有層中膠原纖維的增加在聲帶損傷后明顯，特別是在3個(gè)月時(shí)。正如Branski RC等[6]的研究結(jié)果表明，聲帶損傷后初期，膠原纖維和纖維連接蛋白升高，彈性纖維減少。當(dāng)聲帶損傷時(shí)各種ECM的分泌和釋放逐漸增加，ECM對(duì)聲帶的自身修復(fù)有一定的促進(jìn)作用；但過度分泌的ECM可能會(huì)影響聲帶的修復(fù)能力，主要表現(xiàn)為損傷后1個(gè)月即出現(xiàn)的以膠原為主的纖維組織的增生及沉積，其持續(xù)的增生狀態(tài)保持至損傷后6個(gè)月，膠原纖維作為組織的支撐結(jié)構(gòu)，過度增加的膠原纖維會(huì)使聲帶局部僵硬，是導(dǎo)致聲帶瘢痕形成的主要原因之一。在聲帶損傷的中后期，局部組織開始進(jìn)行重塑[6]，此時(shí)期膠原的含量雖略有降低，但仍明顯高于正常，固有層內(nèi)的膠原纖維呈不規(guī)則柱狀或條索狀排列，表明膠原的無序沉積狀態(tài)可能是聲帶瘢痕形成的主要因素。因此，過度分泌及無序沉積的膠原纖維可能導(dǎo)致受損聲帶局部纖維化，從而使聲帶喪失正常的振動(dòng)功能。

本研究組對(duì)固有層內(nèi)主要ECM的檢測(cè)顯示，損傷后1個(gè)月內(nèi)透明質(zhì)酸（HA）含量略微增加，與對(duì)照組比較無顯著差異。HA被認(rèn)為是維持聲帶正常彈性及聲帶損傷后抑制膠原分泌的主要ECM[7]。Catten等[8]對(duì)間隙蛋白進(jìn)行研究后認(rèn)為，蛋白聚糖特別是HA對(duì)聲帶生物力學(xué)具有重要作用，HA濃度越高則聲帶黏性越高，振動(dòng)緩沖能力越強(qiáng)。提示HA對(duì)聲帶黏膜和固有層缺失修復(fù)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。HA是一種細(xì)胞外基質(zhì)黏多糖，無抗原性，具有黏彈性和吸收沖擊的特性，具有承受聲帶所受振動(dòng)碰撞的理想的生物機(jī)械特性。HA作為減震器，保護(hù)聲帶緣在發(fā)聲中不受振動(dòng)損傷，其促進(jìn)損傷修復(fù)的能力可以減少纖維化和瘢痕形成。此外，HA還在聲帶組織分化、再生、修復(fù)中起重要作用[9，10]。我們可以推斷固有層中膠原纖維的含量變化也會(huì)影響聲帶的損傷后修復(fù)，其含量在中后期的持續(xù)增高直接參與聲帶瘢痕的形成過程，構(gòu)成了聲帶瘢痕一部分，如能在損傷早期適當(dāng)控制膠原纖維的分泌則有可能促進(jìn)聲帶的修復(fù)。因此，如何誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增加HA的分泌，減少膠原纖維的分泌，成為聲帶修復(fù)的關(guān)鍵所在。

本研究結(jié)果提示，在聲帶損傷后成纖維細(xì)胞活性增強(qiáng)，早、中期各種ECM的大量沉積，表現(xiàn)為以膠原纖維為主的纖維組織持續(xù)增生和無序排列、HA少量增多；在聲帶損傷后期各種ECM分泌減少，但膠原纖維含量仍明顯高于正常，聲帶固有層局部的ECM以紊亂的膠原纖維沉積為主，分層結(jié)構(gòu)消失，瘢痕形成，透明質(zhì)酸成分降低。

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（收稿日期：2012-07-30）