王今越，王小虹，馮維斗

摘 要：目的：研究p38、NF—_кB、IL—6在少肌癥發(fā)生及運(yùn)動緩解少肌癥中的作用。方法：24只雄性SD大鼠分為3組，C組（青年安靜組）、S組（40 d D—半乳糖注射致衰組）、E組（40 d D—半乳糖注射+6 w跑臺運(yùn)動組）。檢測C、S、E組大鼠腓腸肌的質(zhì)量、Phospho—p38、p38、Phospho—p65、p65、IL—6 mRNA、MRFs （MyoD、MyoG、Myf—5、MRF4）mRNA。結(jié)果：與C組相比，S組腓腸肌/體重、Phospho—p65、IL—6 mRNA 降低，Phospho—p38、MyoD mRNA、MyoG mRNA、Myf—5 mRNA上升，與S組相比，E組腓腸肌/體重、Phospho—p38、Phospho—p65、IL—6 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MRF4 mRNA升高；MyoD mRNA/MyoG mRNA比值為S組低于C組，E組高于S組；C組、S組、E組p38及p65均無顯著性差異。結(jié)論： NF—_кB與IL—6（或以NF—_кB/IL—6形式）介導(dǎo)、而p38、MyoD、MyoG、Myf—5（或以p38/ MyoD、MyoG、Myf—5形式）拮抗衰老引起肌肉流失（少肌癥）； p38、NF—_кB、IL—6 、MyoD、MyoG、MRF4參與了運(yùn)動對少肌癥的緩解，該過程可能以p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式）/ MyoD、MyoG、MRF4通路形式進(jìn)行；衰老誘導(dǎo)肌肉快—慢轉(zhuǎn)化，運(yùn)動抑制了該轉(zhuǎn)化趨勢；p38、p65表達(dá)對運(yùn)動、衰老不敏感。

關(guān)鍵詞：p38；NF—_кB；IL—6；運(yùn)動；少肌癥

中圖分類號：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006—2076（2012）04—0051—06

Abstract：Objectvie： Explorer the function of p38， NF—？B and IL—6 in pathogenesis of sarcopenia and it`s exercise—induced improvement. Methods： 24 male SD rats were divided into 3 groups： C group（quiet young group）， S group（40 day D—Glactose injection—induced senecence）， E group（40 days D—Glactose injection—induced senecence +6weeks exercise on treadmill）. It detected the body weight， gastrocnemius weight， Phospho—p38， p38， Phospho—p65， p65， IL—6 mRNA， MRFs（MyoD， MyoG， Myf—5， MRF4）mRNA. Results： There was lower ratio of gastrocnemius weight to body weight， Phospho—p65， IL—6 mRNA， higher Phospho—p38， MyoD mRNA， MyoG mRNA， Myf—5 mRNA in S group than C group. There was higher ratio of gastrocnemius weight to body weight， Phospho—p38， Phospho—p65， IL—6 mRNA， MyoD mRNA， MyoG mRNA， MRF4 mRNA in E group than S group. There is lower or higher ratio of MyoD mRNA to MyoG mRNA in S group than C group or than E group. No change of p38 or p65 in S or E group compared with C group. Conclutions： NF—_кB and IL—6 meditated but p38， MyoD， MyoG， Myf—5 resisted sarcopenia which may be meditated by NF—_кB， IL—6 and resisted by p38/ MyoD， MyoG， Myf—5； p38， NF—_кB， IL—6， MyoD， MyoG， MRF4 contributed to exercise—induced improvement of sarcopenia which may be meditated by p38， NF—_кB， IL—6（or p38/NF—_кB/IL—6）/ MyoD， MyoG， MRF4； Senescence induced “fast to slow” type transformation in skeletal muscle and the transformation was inhibited by exercise. Both p38 and p65 are insensitive to senescence and exercise.

Key words：p38；NF—_кB；IL—6；exercise；sarcopenia

少肌癥是一種普遍存在于老年人群的增齡性肌肉質(zhì)量和力量退行性損失的疾病，它限制人體活動能力，間接加重了多種老年常見癥狀（II型糖尿病、動脈硬化、骨質(zhì)疏松），降低了老年人的生活質(zhì)量，提高了健康成本和社會負(fù)擔(dān)。規(guī)律的運(yùn)動可改善肌肉的結(jié)構(gòu)和功能，對于預(yù)防和緩解少肌癥作用明顯，然而其分子機(jī)制，特別是細(xì)胞內(nèi)機(jī)制仍然不甚明了。

p38/NF—_кB/IL—6是近年小鼠C2C12細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生肌通路，該通路激活能夠上調(diào)肌肉特異性基因，對肌肉干細(xì)胞分化和成熟肌纖維發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用[1—2]，生肌通路信號的衰減、激活分別通常介導(dǎo)了肌肉萎縮和肥大，而肌肉萎縮、肥大也正分別是少肌癥發(fā)生和緩解過程的關(guān)鍵事件。筆者推測，p38、NF—_кB、IL—6可能以通路形式介導(dǎo)了少肌癥發(fā)生及運(yùn)動對它的緩解過程。目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究通過檢測運(yùn)動、衰老（由D—半乳糖誘導(dǎo)）雙重干預(yù)下大鼠的腓腸肌比重、p38、NF—_кB、IL—6，及生肌因子MRFs（MyoD、MyoG、MRF4、Myf—5）的變化在少肌癥發(fā)生及少肌癥運(yùn)動性緩解過程中的聯(lián)系和作用，探索少肌癥發(fā)生及其運(yùn)動性干預(yù)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物分組及運(yùn)動方案

購入24只清潔級雄性10 w、250～300 g SD大鼠。適應(yīng)性訓(xùn)練3 d后隨機(jī)分組：C組6只、S、E組各9只，次日（周一）執(zhí)行表1方案。各組大鼠自由進(jìn)食，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度23℃，濕度40%～60%。

1.2 取材

大鼠以斷頸椎方式處死（處死前2 h禁食），稱重后取右后腿腓腸肌，用4℃預(yù)冷的生理鹽水清洗，去處血污，濾紙吸干水分，稱重后切分成數(shù)段，錫箔紙包裹，做好標(biāo)簽，浸入液氮30 min后放入—80℃超低溫冰箱冷凍待測。（注：意外死亡或無法完成運(yùn)動方案而淘汰大鼠，E組有2只。）

1.3 主要試劑及試劑盒

D—半乳糖，Sigma公司；Phospho—p38 （Thr 180/Tyr 182）抗體與p38抗體（Rabbit，43KD）、Phospho—p65 （Ser536）抗體與p65抗體（Rabbit，65 KD）、tubulin抗體（Rabbit，55KD），cell signaling；Trizol總RNA提取kit，碧云天；Biort RT—PCR assasy kit：博日公司；細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取kit：生工公司。

1.4 方法

1.4.1 腓腸肌比重

腓腸肌比重=大鼠右后腿腓腸肌濕重/處死時的體重*（100/%）

1.4.2 Phospho—p38、p38、Phospho—p65 、p65

（1）細(xì)胞蛋白提取：取50～100 mg腓腸肌放入小燒杯中，加入1 ml提前預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（210 mM甘露醇，70 mM蔗糖，5 mM Tris—HCl，1 mM EDTA，0.1 mM PMSF，0.5 mM DTT，10 mM NaF）。剪碎肌組織，去除結(jié)締組織、脂肪等。電動勻漿，轉(zhuǎn)速1 500～1 800 rpm，使組織勻漿化。勻漿液倒入離心管，1 400 g 4℃離心10 min；吸取上清即蛋白樣品，BCA法定量。

（2）western blotting測定上述蛋白含量。一般步驟略，聚丙烯酰胺凝膠濃度10%；抗體稀釋（P—p38 1：1000；p38 1：1200；P—p65 1：900；p65 1：1200；tubulin 1：2000）；蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值，以內(nèi)參tubulin校正。

1.4.3 IL—6 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA、Myf—5 mRNA、MRF4 mRNA

按照Trizol Reagent液說明書提取總RNA，總RNA的質(zhì)量和純度檢測采用變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光檢測OD260/OD280比值，依據(jù)質(zhì)量和純度選取符合RT—PCR要求的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照Biort RT—PCR kit說明書進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，總RNA經(jīng)RT反應(yīng)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25μL體系。PCR循環(huán)條件： （1）95℃ 5 min，（2）95℃ 30 s，（3）（IL—6：58℃；MyoD：60℃；MyoG：62℃；Myf—5：60℃；MRF4：60℃）40s，（4）72℃ 1 min，（5）回至第2步，25個循環(huán)，（6）72℃ 10 min，（7）保持在4℃。 PCR產(chǎn)物加樣于2%瓊脂糖凝膠、電泳（上樣量12 ul，6 x DNA loading buffer 2 ul，電壓150 v，電泳35 min）。mRNA含量為條帶的OD值，以內(nèi)參GAPDH校正。

引物（5–3）如下：（1）IL—6 F：GACTGATGTTGCTGACAGCCACTGC R TAGCCACTGCTTCTGTGACTCTAACT（509kp）；（2）MyoD F：CCCGACGCGTCTCTCTGCTCCTT R： CGCCTGGCGCTGGGTGCA（178kp）；（3）MyoG F： GAGCGCGATCTCCCGTCAAGAGG· R：CTGGCTTGTGCGAGCCCAGG（688kp）；（4）Myf—5 F：GAGCCAGAAGTAGCAGCCTTCG R： GTTCTTTCGGGACACGACAGGG（441kp）；（5）MRF4 F：AGAGACTCGCCAAGGTGGAGATTCR： AAGACTGCTGGAGGCTGGAGCATC（272kp）；（6）GAPDH F：CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT R：AGGGGCCATCCACAGTCTTC（595kp）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（x[DD（—*2]—[][DD）]±s）， One—Way ANOVA分析，有顯著差異，則SNK法對數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 體重、腓腸肌質(zhì)量、腓腸肌比重

3 討論

3.1 衰老、運(yùn)動對腓腸肌比重影響

本研究表明，腓腸肌比重為S組下降（S組變化均指與C組相較，下同），E組上升（E組變化均指與S組相較，下同）。結(jié)果提示，衰老大鼠的肌肉比例下降，而長期規(guī)律的運(yùn)動有其緩解作用，結(jié)果符合少肌癥發(fā)生及其運(yùn)動性緩解的研究目的。

3.2 衰老、運(yùn)動對P—p38、p38、P—p65、p65、IL—6 mRNA的影響

p38是骨骼肌發(fā)育的主要調(diào)節(jié)器，成肌細(xì)胞中，p38激活是肌肉特異性基因表達(dá)、細(xì)胞分化的必要前提，成熟肌纖維中，p38激活后也可以通過上調(diào)生肌因子MRFs表達(dá)、活性及重塑肌肉特異性調(diào)節(jié)區(qū)域組蛋白誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白表達(dá)，促進(jìn)肌纖維發(fā)育[2， 5—6]。以往研究顯示，p38總量對理化刺激不敏感，但活性敏感易變，衰老肌肉P—p38（p38活性標(biāo)志）上調(diào)[7—9]，急性運(yùn)動后，肌肉P—p38一過性上調(diào)，24 h內(nèi)通?？苫謴?fù)正常[10—11]，長期訓(xùn)練后，P—p38穩(wěn)定上調(diào)[7]。與以往報(bào)道一致，本研究顯示， S組（vs C組）、E組（vs S組）P—p38均上調(diào)，二組p38總量未變（vs C組）。對比可知，P—p38且與腓腸肌比重變化一致。結(jié)果提示：衰老肌肉中，p38活性上調(diào)拮抗肌肉流失（少肌癥），長期訓(xùn)練進(jìn)一步提高了衰老肌肉p38拮抗少肌癥的能力。筆者推測，衰老肌肉p38活性的升高是受ROS、炎癥因子上調(diào)的影響，而訓(xùn)練后p38活性進(jìn)一步升高則與胰島素受體敏感性改善有關(guān)，因?yàn)橐酝芯勘砻?，ROS、炎癥水平、胰島素均能激活p38，且前兩者隨衰老升高，而胰島素受體敏感性在規(guī)律的運(yùn)動后改善[2， 5—6]。

NF—_кB激活常與炎癥、細(xì)胞損傷、蛋白降解、組織萎縮相伴隨，然而，近年多項(xiàng)離體和體內(nèi)研究顯示NF—_кB對肌肉發(fā)生有積極作用，且這個過程受p38調(diào)控——IGF—II誘導(dǎo)的L6E9大鼠成肌細(xì)胞發(fā)生過程中，NF—_кB激活[12]，大鼠2 w跑臺運(yùn)動誘導(dǎo)的腓腸肌肥大幅度可以被NF—_кB阻斷所抑制[13]，NF—_кB阻斷下調(diào)了C2C12細(xì)胞某些結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的表達(dá)，p38阻斷后，上述結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白同樣下調(diào)，且NF—_кB活性也下調(diào)[1]。有研究顯示，p38激活能誘導(dǎo)IкB（NF—_кB抑制劑）從NF—_кB分離，提高其活性[14]。Ho提出，持續(xù)的NF—_кB激活引起肌肉損傷和流失（如傷?。?，間歇式的NF—_кB激活促進(jìn)正常肌肉發(fā)育（如運(yùn)動）[15]。Ho的假設(shè)能夠較好解釋NF—_кB對肌肉作用的矛盾結(jié)果，但是沒有揭示其原因。轉(zhuǎn)錄因子NF—_кB的生物學(xué)作用依賴于其靶基因功能，它的靶基因既包括了TNF—α、Il—2等介導(dǎo)炎癥基因，也包括Bcl—2、IL—6等抗凋亡或促生肌的基因。筆者認(rèn)為，NF—_кB矛盾的作用可能是它在不同條件下選擇性激活不同功能的靶基因表達(dá)所致，該假設(shè)有待驗(yàn)證，如確實(shí)如此，其選擇性機(jī)制也是以后研究值得關(guān)注的方向。本研究表明， P—p65（NF—_кB活性標(biāo)志）為S組下降（vs C組），E組（vs S組）升高，兩組p65未變（vs C組）。本結(jié)果與Song報(bào)道[16]一致，該研究報(bào)道，衰老大鼠腓腸肌的比重（腓腸肌重量/體重）、NF—_кB活性、Bcl—2/Bax比值降低，12 w跑臺后上述指標(biāo)變化均提高。P—p65與腓腸肌比重變化（S、E組分別為下降、上升）一致，提示，NF—_кB介導(dǎo)了少肌癥發(fā)生及運(yùn)動對少肌癥的抑制緩解。與P—p38（S、E組均上升）相比，P—p65 S組變化與其相悖，但E組一致，提示，衰老肌NF—_кB活性下降與p38無關(guān)，運(yùn)動引起的NF—_кB活性上調(diào)可能受p38支配。

IL—6是NF—_кB靶基因。IL—6對肌肉發(fā)育有積極作用——IL—6小鼠的發(fā)育明顯遲緩，肌肉比例降低[17]。衰老動物循環(huán)中IL—6水平升高，但近來研究報(bào)道，升高的IL—6源于白色脂肪和單核細(xì)胞[18]，衰老肌肉IL—6報(bào)道鮮見，僅見Hamada的報(bào)道“老年人股外側(cè)肌IL—6 mRNA低于青年人”[19]。急性高強(qiáng)度運(yùn)動后，肌肉IL—6 mRNA能夠上升幾十倍，長期運(yùn)動報(bào)道較少且結(jié)果較為矛盾，青年大鼠2 w的大強(qiáng)度上坡跑臺訓(xùn)練及成年男子10 w的伸膝訓(xùn)練未改變腿肌IL—6 mRNA水平[13， 20]，而虛弱且肥胖的老年人在12 w有氧結(jié)合抗組訓(xùn)練后，股外側(cè)肌IL—6 mRNA下降50%[21]。本研究表明，IL—6 mRNA S組降低（vs C組），E組升高（vs S組），與NF—_кB活性變化一致。提示，IL—6可能承繼NF—_кB信號，參與少肌癥發(fā)生及運(yùn)動對少肌癥的緩解過程。本研究“訓(xùn)練上調(diào)IL—6 mRNA”的結(jié)果與以往報(bào)道皆不同，推測可能與測試對象衰老程度、訓(xùn)練方式、訓(xùn)練周期的差異有關(guān)。

綜上提示：p38拮抗而NF—_кB、IL—6（或以NF—_кB/IL—6形式）介導(dǎo)少肌癥發(fā)生；p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式）參與了運(yùn)動對少肌癥的緩解過程。

3.3 衰老、運(yùn)動對MRFs mRNA的影響

MRFs（MyoD、MyoG、Myf—5、MRF4）是重要生肌效應(yīng)分子，在成體肌纖維及衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)。成體肌纖維中，MRFs與MEF2和E蛋白協(xié)同下激活肌肉特異性基因（如α—actin、煙堿乙酰膽堿受體、原肌球蛋白、MHC、結(jié)蛋白、肌鈣蛋白C、CK、MCK等）轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)蛋白更替、肌肉質(zhì)量及功能提高。肌肉干細(xì)胞中，MyoD、Myf—5上調(diào)誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖并進(jìn)入生肌系，MRF4、MyoG上調(diào)則引導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞終末分化[22]。

本研究表明，S組MyoD、MyoG、Myf—5 mRNA均上升，MRF4 mRNA不變，MyoD mRNA/MyoG mRNA降低（vs C組）。提示，MyoD、MyoG、Myf—5參與了少肌癥拮抗。本結(jié)果與以往Raue、Kim等衰老肌MRFs mRNA上調(diào)報(bào)道一致[23—24]。Raue認(rèn)為，衰老肌肉MRFs mRNA的上調(diào)意義在于對抗肌肉質(zhì)量和功能的下降，且其上調(diào)是衰老肌肉神經(jīng)退化所致[23]。MyoD mRNA/MyoG mRNA是快慢纖維比例標(biāo)志，S組該比值降低表明衰老肌快—慢轉(zhuǎn)化，符合衰老肌肉快肌纖維比例下降更明顯的規(guī)律。本研究表明，E組MyoD、MyoG、MRF4 mRNA升高，Myf—5 mRNA不變，MyoD mRNA/MyoG mRNA升高（vs S組）。提示：運(yùn)動能通過MyoD、MyoG、MRF4上調(diào)拮抗少肌癥；運(yùn)動抑制了衰老肌肉快—慢的轉(zhuǎn)化。筆者以往研究發(fā)現(xiàn)，青年大鼠大強(qiáng)度2 w上坡跑臺后，其腓腸肌Myf—5 mRNA上調(diào)、MRF4 mRNA不變[13]，該結(jié)果與本研究“E組Myf—5 mRNA不變、 MRF4mRNA上調(diào)”不同，提示，衰老動物與青年動物MRF4、Myf—5對運(yùn)動應(yīng)答的模式可能有較大差異，其機(jī)制意義待查，當(dāng)然也不排除與訓(xùn)練期不同有關(guān)（2 w vs 8 w）。也有研究顯示一段時間耐力訓(xùn)練后，大鼠肌肉MyoD、MyoG mRNA均降低[25]。一般而言，耐力訓(xùn)練對于肌肉量保持是有益的，生肌因子或者不變，但不應(yīng)降低，筆者尚不能解釋其原因，有待調(diào)查，這也表明MRFs調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。值得注意的是，本研究無法區(qū)分MRFs改變源于成熟肌纖維或衛(wèi)星細(xì)胞，如果源于衛(wèi)星細(xì)胞，那么衰老、運(yùn)動對少肌癥的影響（介導(dǎo)、抑制）分別是衛(wèi)星細(xì)胞抑制、激活的結(jié)果，如果源于成熟肌纖維，則分別是成熟肌纖維自身蛋白更替抑制、加強(qiáng)的結(jié)果。Raue等曾討論過類似問題，該研究提出，升高的MRFs應(yīng)主要源于成熟肌纖維，因?yàn)樗ダ霞∪鈩訂T已經(jīng)縮小的衛(wèi)星細(xì)胞池來對抗肌肉質(zhì)量功能降低，不如動員大量現(xiàn)成的成熟肌纖維細(xì)胞本身蛋白更替有效率，該研究認(rèn)為，長期訓(xùn)練引起的MRFs改變可能是成熟肌纖維肌及衛(wèi)星細(xì)胞共同作用的結(jié)果[23]。該結(jié)論有待調(diào)查。

聯(lián)系上述p38、NF—_кB、IL—6改變及MRFs作為重要生肌效應(yīng)分子和生肌通路重要樞紐的特點(diǎn)，可以推測，衰老肌肉MyoD、MyoG、Myf—5的升高可能與p38活性提高有關(guān)，運(yùn)動引起衰老肌肉MyoD、MyoG、MRF4上調(diào)可能是p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式存在）活性或表達(dá)上調(diào)所致。

4 總結(jié)

衰老大鼠腓腸肌的比重、Phospho—p65、IL—6 mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA降低，Phospho—p38、MyoD mRNA、MyoG mRNA、Myf—5 mRNA上升，長期運(yùn)動后，衰老大鼠腓腸肌的比重、Phospho—p38、Phospho—p65、IL—6 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MRF4 mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA升高。衰老及長期運(yùn)動大鼠腓腸肌的p38及p65水平未改變。研究提示：NF—_кB與IL—6（或以NF—_кB/IL—6形式）介導(dǎo)、而p38、MyoD、MyoG、Myf—5（或以p38/ MyoD、MyoG、Myf—5形式）拮抗衰老引起肌肉流失（少肌癥）； p38、NF—_кB、IL—6 、MyoD、MyoG、MRF4參與了運(yùn)動對少肌癥的緩解，該過程可能以p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式）/ MyoD、MyoG、MRF4通路形式進(jìn)行；衰老誘導(dǎo)肌肉快—慢轉(zhuǎn)化，運(yùn)動抑制了該轉(zhuǎn)化趨勢；p38、p65表達(dá)對運(yùn)動、衰老不敏感。條件所限，本研究一些問題值得注意：D—半乳糖致衰模型不能完全模擬衰老特征，結(jié)論應(yīng)在天然衰老動物驗(yàn)證；諸因子關(guān)聯(lián)和作用需通過激動劑、阻斷劑驗(yàn)證； mRNA不是反映轉(zhuǎn)錄因子MRFs功能變化理想指標(biāo)，未來應(yīng)該考慮檢測它們的DNA結(jié)合活性。

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