葛新發(fā),董貴俊，王宏巍,王超,李可峰，潘衛(wèi)東

摘 要：枸杞是運(yùn)動(dòng)員飲食中常用的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，對(duì)運(yùn)動(dòng)后體能恢復(fù)、免疫能力提高等具有重要作用。為了研究補(bǔ)充枸杞對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化的影響，對(duì)Wistar大鼠6周枸杞灌喂后進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)，觀察運(yùn)動(dòng)后即刻、24 h、48 h、72 h的大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)變化。發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠比目魚(yú)肌在運(yùn)動(dòng)后即刻至48 h間超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化，表現(xiàn)為Z線的紊亂、肌纖維斷裂、線粒體結(jié)構(gòu)改變及肌核內(nèi)移等現(xiàn)象。表明補(bǔ)充枸杞能顯著改善力竭運(yùn)動(dòng)后即刻至48 h比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)損傷，加速骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：大鼠；枸杞；比目魚(yú)?。怀⒔Y(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006—2076（2012）04—0046—05

Abstract：As one of nutritional supplements in athletes diet， wolfberry plays an important role in physical and immunity recovery after exercise. In order to study the effects of wolfberry on rat skeletal muscle ultrastructure after exhaustive exercise， rats were exercised exhaustive after six weeks supplement wolfberry and were observed ultrastructural changes of the soleus muscle in 0h， 24h， 48h and 72h after exhaustive exercise. The results showed that ultra—microstructure of rat soleus were changed significantly from 0h to 48h after exhaustive exercise with fractured muscle fiber， muscle interstitial edema， inflammatory cell infiltration and myocyte necrosis degeneration. Added wolfberry can significantly improve the ultrastructure of micro—damage in soleus muscle from 0h to 48h after exhaustive exercise， which show complement wolfberry accelerate recovery of skeletal muscle ultrastructure and skeletal muscle micro—damage repair after exhaustive exercise.

Key words：rats； wolfberry； soleus； ultrastructure

枸杞是一種傳統(tǒng)名貴藥材，具有“紅寶”之稱，其成分為枸杞多糖、甜菜堿等及多種微量元素和氨基酸[1]。枸杞具有的延緩疲勞、抗氧化、滋陰補(bǔ)腎等作用可能與枸杞多糖及血清酶存在的指標(biāo)關(guān)系相關(guān)聯(lián)[2]。同時(shí)，枸杞水煎液、提取物、口服液能有效提高小鼠持續(xù)游泳時(shí)間，說(shuō)明枸杞能顯著提高小鼠的抗疲勞能力[2—3]；對(duì)機(jī)體補(bǔ)充枸杞多糖能降低血清中乳酸含量，提高骨骼肌在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中利用氧的能力以及心血管系統(tǒng)供氧能力，增強(qiáng)機(jī)體的有氧代謝能力等[3—5]。在力竭運(yùn)動(dòng)中，補(bǔ)充枸杞能夠明顯改善機(jī)體成分，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，有效預(yù)防肌肉損傷的發(fā)生。力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致循環(huán)血量重新分布及大量乳酸的堆積，肌細(xì)胞膜受損，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)破壞、嵴消失且血清酶活性升高，補(bǔ)充枸杞能有效緩解血清酶上升幅度，從而起到對(duì)肌纖維的保護(hù)作用[6]。目前對(duì)枸杞在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的研究主要集中在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中抗疲勞作用的生理、生化指標(biāo)的分析，對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)過(guò)程中骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化的影響研究尚未發(fā)現(xiàn)。

本研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)后引起的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究，觀察補(bǔ)充枸杞后大鼠力竭運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化，從組織學(xué)分析補(bǔ)充枸杞對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)中大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響，探討補(bǔ)充枸杞對(duì)大鼠比目魚(yú)肌損傷恢復(fù)的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及喂養(yǎng)方法

購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心雄性Wistar大鼠共90只，體重157.6±6.0 g，室溫保持在23℃左右，相對(duì)濕度（55±5）%，光照時(shí)間為7：00—19：00，自由飲食。隨機(jī)分為6個(gè)組，其中自由飲食組、補(bǔ)充安慰劑組、補(bǔ)充枸杞組作為對(duì)照組（每組6只），自由飲食運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)充安慰劑運(yùn)動(dòng)組、補(bǔ)充枸杞運(yùn)動(dòng)組作為運(yùn)動(dòng)組（每組24只）。

1.2 枸杞灌喂方式

將枸杞用蒸餾水洗干凈后浸泡30分鐘，分兩次煎煮，每次煮沸后加煮10分鐘，分別過(guò)濾一起搖勻，制成濃度相當(dāng)于生藥量1 g/ml 的100%的水煎劑，灌喂劑量為10 g/kg體重。補(bǔ)充安慰劑組灌喂相同劑量的生理鹽水。每天稱重兩次，以根據(jù)體重確定補(bǔ)充的劑量[1]。

1.3 運(yùn)動(dòng)的條件及方案

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及運(yùn)動(dòng)組實(shí)驗(yàn)均為期6周，然后利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)一次，參照文獻(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)前讓大鼠跑臺(tái)適應(yīng)1周，第一天以5 m/min，第二天以10 m/min，第三天以15 m/min的速度運(yùn)動(dòng)直到1周 ，每次運(yùn)動(dòng)持續(xù)15 min。休息1天，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)（25 m/min，5%坡度，相當(dāng)于75%VO2max）[8]。力竭組以大鼠臀部壓在跑臺(tái)后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30秒以上，驅(qū)趕無(wú)效，并有呼吸加深的現(xiàn)象、神態(tài)倦怠、俯臥位、垂頭等特征為力竭標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 樣本取材及電鏡標(biāo)本制作

觀察運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)后即刻、24 h、48 h、72 h的大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)變化。力竭運(yùn)動(dòng)后即刻、24 h、48 h、72 h取大鼠兩側(cè)的比目魚(yú)肌，將一側(cè)比目魚(yú)肌組織放入冰冷的生理鹽水中清洗，統(tǒng)一標(biāo)記并凍存，而將另外一側(cè)的比目魚(yú)肌組織切割成0.5 mm×0.5 mm×5 mm的長(zhǎng)方體塊狀標(biāo)本，立即置于2.5%戊二醛固定液中固定，0℃～4℃保存。

2.5%戊二醛固定骨骼肌的標(biāo)本后，將標(biāo)本置于4℃ 的0.1 M PBS緩沖液中過(guò)夜保存，取出后充分在緩沖液中以大概15分鐘的間隔沖洗4次，然后加1%餓酸同樣放置在4℃的環(huán)境內(nèi)固定2 h，再用以上同樣的方式在緩沖液中進(jìn)行沖洗，完畢后用梯度乙醇丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，然后把包埋的標(biāo)本塊切制成半薄切片，隨后光鏡定位，再用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，切片最后用鈾—鉛雙染制片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 自由飲食組、補(bǔ)充安慰劑組、補(bǔ)充枸杞組大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)

自由飲食組、補(bǔ)充安慰劑組、補(bǔ)充枸杞組電子顯微鏡下均顯示肌纖維排列整齊，肌節(jié)形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，A、I、H帶以及M線完整清晰，肌膜、核膜完整，線粒體、肌核完整，Z線完整連續(xù)，無(wú)異?，F(xiàn)象（見(jiàn)圖1）。

2.2 力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)變化情況

運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)后即刻切片均顯示明顯的Z線不連續(xù)，呈波紋狀，其完整性被破壞，并出現(xiàn)腫脹的線粒體；自由飲食、補(bǔ)充安慰劑運(yùn)動(dòng)組與補(bǔ)充枸杞運(yùn)動(dòng)組相比，Z線排列更加紊亂。

2.3 力竭運(yùn)動(dòng)后24 h大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)變化情況

力竭運(yùn)動(dòng)后24 h自由飲食組與安慰劑組超微結(jié)構(gòu)的損傷明顯，損傷程度高于即刻組，損傷程度嚴(yán)重，如大量線粒體發(fā)生腫脹，肌核腫脹，固縮，空泡變性，嵴紊亂，肌膜皺縮，肌細(xì)胞腫脹，Z線出現(xiàn)異常，部分肌基膜分離，部分肌膜出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。巨噬細(xì)胞、間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞等（如圖4）。運(yùn)動(dòng)后24 h補(bǔ)充枸杞組的損傷情況比補(bǔ)充即刻組有所增加，與運(yùn)動(dòng)后24 h自由飲食組和安慰劑組相比較輕（如圖5），線粒體在體積上有腫脹現(xiàn)象，其數(shù)目稍微增多，肌細(xì)胞腫脹，Z線異常，嵴紊亂，巨噬細(xì)胞、間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞等，屬局灶性損傷。

2.4 力竭運(yùn)動(dòng)后48 h大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)變化情況

力竭運(yùn)動(dòng)后48 h自由飲食組與安慰劑組超微結(jié)構(gòu)的損傷有減輕的趨勢(shì)，出現(xiàn)逐漸修復(fù)現(xiàn)象。損傷程度在局灶性與嚴(yán)重之間，如線粒體發(fā)生腫脹、肌核腫脹，固縮，空泡變性，嵴紊亂，肌膜皺縮，肌細(xì)胞腫脹，Z線出現(xiàn)異常，部分肌基膜分離，部分肌膜出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。巨噬細(xì)胞、間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞等（如圖6），屬局灶性損傷。運(yùn)動(dòng)后48 h補(bǔ)充枸杞組的損傷情況輕于補(bǔ)充枸杞24 h組、自由飲食與安慰劑48 h組（如圖7），線粒體在體積上有腫脹現(xiàn)象，其數(shù)目稍微增多，肌細(xì)胞腫脹，Z線異常，嵴紊亂，間質(zhì)偶見(jiàn)具有增殖趨勢(shì)的衛(wèi)星細(xì)胞等，屬局灶性損傷。

2.5 力竭運(yùn)動(dòng)后72 h大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)變化情況

自由飲食組與安慰劑組力竭運(yùn)動(dòng)后72 h與48 h相比超微結(jié)構(gòu)的損傷逐漸好轉(zhuǎn)出現(xiàn)修復(fù)，線粒體在體積上有腫脹現(xiàn)象，其數(shù)目稍微增多，肌細(xì)胞腫脹，基膜部分分離，Z線異常，嵴紊亂，間質(zhì)偶見(jiàn)具有增殖趨勢(shì)的衛(wèi)星細(xì)胞等（如圖8）。運(yùn)動(dòng)后72 h補(bǔ)充枸杞組的損傷情況在修復(fù)周期過(guò)程中明顯優(yōu)于自由飲食組與安慰劑組（如圖9）。衛(wèi)星細(xì)胞在間質(zhì)中出現(xiàn)增殖，肌細(xì)胞中的染色質(zhì)有凝聚現(xiàn)象出現(xiàn)，基膜逐漸形成，向衛(wèi)星細(xì)胞慢慢轉(zhuǎn)變。

3 討論

長(zhǎng)時(shí)間或力竭運(yùn)動(dòng)后造成的骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)的改變，稱運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微細(xì)損傷。這種損傷的發(fā)生有復(fù)雜的多種因子參與，其損傷機(jī)制也有很多的假說(shuō)，如代謝學(xué)說(shuō)、機(jī)械學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)等。這些學(xué)說(shuō)均認(rèn)為，胞漿內(nèi)容物泄漏以及胞外鈣離子大量進(jìn)入是肌細(xì)胞膜的損傷、完整性喪失的直接原因[8]，而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷后會(huì)引起一系列肌纖維微結(jié)構(gòu)的改變。所以，運(yùn)動(dòng)中若能通過(guò)對(duì)機(jī)體補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑來(lái)維持肌細(xì)胞膜的正常功能及完整性，可減輕肌肉微損傷的程度，維持運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力及身體機(jī)能。

在電子顯微鏡觀察下，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化以肌小節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)形式，如肌原纖維排列紊亂，Z線排列不整齊，線粒體數(shù)量減少。骨骼肌超[LL]微結(jié)構(gòu)的變化與運(yùn)動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)度等均有關(guān)，時(shí)間持續(xù)越長(zhǎng)、強(qiáng)度越大及非習(xí)慣性負(fù)荷，運(yùn)動(dòng)損傷越明顯。

造成骨骼肌微損傷的運(yùn)動(dòng)方式以離心運(yùn)動(dòng)最為顯著，尤其是下坡跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，目前大量的研究都證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)[9—11]，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中骨骼肌延遲性酸痛現(xiàn)象很常見(jiàn)，這些現(xiàn)象被認(rèn)為是一個(gè)從刺激到適應(yīng)的過(guò)程[12]。本研究中，大鼠在進(jìn)行一次性力竭離心運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了同樣的明顯變化。研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌運(yùn)動(dòng)后即刻至24 h超微結(jié)構(gòu)的變化表現(xiàn)為：肌纖維斷裂，Z線異常、出現(xiàn)波紋狀，線粒體空泡化。這一系列變化在24 h以后取樣切片中最明顯，其中肌節(jié)明、暗帶的排列紊亂是骨骼肌形態(tài)學(xué)在電鏡下觀察的一些現(xiàn)象[6，12—13]。這些微變化都是機(jī)體對(duì)長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度、非習(xí)慣性負(fù)荷刺激所做出的反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充枸杞可減輕力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)的一系列形態(tài)學(xué)的改變。運(yùn)動(dòng)后48 h，補(bǔ)充枸杞組骨骼肌微損傷修復(fù)速度明顯優(yōu)于自由飲食組和安慰劑組，說(shuō)明補(bǔ)充枸杞在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過(guò)程中對(duì)骨骼肌的損傷有明顯的預(yù)防及促進(jìn)修復(fù)作用。

4 結(jié)論

力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠比目魚(yú)肌在運(yùn)動(dòng)后即刻至48 h間超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化，表現(xiàn)為肌纖維斷裂、Z線改變、線粒體減少等。補(bǔ)充枸杞能顯著改善力竭運(yùn)動(dòng)后48 h比目魚(yú)肌超微結(jié)構(gòu)微損傷狀況，表明枸杞在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過(guò)程中對(duì)骨骼肌的損傷存在保護(hù)作用，對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌微損傷的修復(fù)具有促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李東哲，李?lèi)?ài)紅.百合、枸杞對(duì)運(yùn)動(dòng)能力影響機(jī)制的探討[J].瓊州學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，（2）：56—58.

[2]李國(guó)莉，任彬彬，楊建軍，等.枸杞多糖對(duì)小鼠耐力及體內(nèi)抗氧化酶活性的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2002，29（10）：634—637.

[3]甘璐，張聲華.枸杞多糖的抗腫瘤活性和對(duì)免疫功能的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2003， 25（2）：200—202.

[4]彭曉東，沈詠.枸杞多糖對(duì)電刺激離體蟾蜍腓腸肌疲勞的影響[J].中草藥，2000，31（5）：356—358.

[5]丁得，張得鈞.枸杞對(duì)小鼠急性運(yùn)動(dòng)后自由基代謝的影響[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，（1）：55—58.

[6]徐冬青，陳家琦，李靜先.力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌自由基代謝及肌細(xì)胞膜通透性的影響[J].天津體育學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，14（3）：27—30.

[7]Hollander J，F(xiàn)iebig R，Gore M，[WTBX]et al.[WTBZ]Superoxide dismutasegene expression is activated by a single bout of exercise in rat skeletal muscle[J].Pflügers Arch，2001，442（3）：426—434.

[8]ClarksonP，HubalM.J.Exereise—indued MuscleDamageinhumans[J].Am J Phys Med Rehabil， 2002，81 （llsuPPI）：552—569.

[9]田野.運(yùn)動(dòng)性骨骼肌疲勞機(jī)理研究[M].北京：北京體育大學(xué)出版社，1998.

[10]馬建，等.中醫(yī)外治方法對(duì)兔骨骼肌連續(xù)離心訓(xùn)練后形態(tài)學(xué)與組織病理學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2000，19（1）：19—23.

[11]李開(kāi)剛，陸紹中.不同強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)適應(yīng)性變化的研究[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2000，19（l）：39—42.

[12]金其貫，劉霞，李淑艷，常永娜，李寧川.反復(fù)離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌損傷和蛋白質(zhì)降解機(jī)制的影響[J].體育科學(xué)，2010，23（2）：39—40.

[13]張海平，宋吉銳.一次力竭性離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肱三頭肌超微結(jié)構(gòu)的影響[J].上海體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，32（5）：44—47.