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微波輔助提取-HPLC法測定神秘果種子中齊墩果酸

2012-04-29 14:29:38盧圣樓等
湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年4期
關(guān)鍵詞:超聲提取高效液相色譜

盧圣樓等

摘要:通過微波輔助提取法與超聲提取法的比較研究與優(yōu)化,確定提取神秘果(Synsepalum dulcificum Daniell)種子中齊墩果酸的最佳工藝條件,采用HPLC法測定神秘果種子中齊墩果酸的含量。結(jié)果表明微波輔助提取法具有操作簡單、提取時間短和提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞:神秘果(Synsepalum dulcificum Daniell);微波輔助提取法;超聲提取;高效液相色譜;齊墩果酸

中圖分類號:S667;O657.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2012)04-0816-04

神秘果(Synsepalum dulcificum Daniell)為山欖科神秘屬常綠灌木植物,其果實(shí)中含有的神秘果素(Miraculin)是一種變味蛋白,果肉在嘴中咀嚼后,再食酸味食物時其味道會轉(zhuǎn)甜[1]。20世紀(jì)60年代引入我國,在海南、云南、廣西等熱帶、亞熱帶地區(qū)小面積種植。神秘果可用作食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域的增甜劑、助食劑和食用色素等[2-7]。隨著對神秘果研究的不斷深入,其營養(yǎng)保健作用也日益受到關(guān)注。

近年來,微波輔助提取法(Microwave assisted extraction,MAE)與超聲波提取法(Ultrasonic extraction,UE)因具有提取效率高、操作簡單方便、無污染、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn),在天然產(chǎn)物提取方面得到了廣泛應(yīng)用[8-12]。本試驗(yàn)分別采用微波輔助提取法、超聲波提取法從神秘果種子中提取齊墩果酸,根據(jù)齊墩果酸的提取率確定最佳提取方法,并采用HPLC法測定齊墩果酸的含量,旨在為今后神秘果的開發(fā)利用提供相關(guān)方法。

1材料與方法

1.1材料

神秘果采集于海南省尖峰嶺國家森林保護(hù)區(qū),經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯高級實(shí)驗(yàn)師鑒定,神秘果種子經(jīng)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干后,粉碎至60目備用。

羰基鐵粉(Carbonyl iron powder,CIP)購于陜西興化化學(xué)股份有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購于四川維克奇生物科技有限公司;正己烷、無水乙醇、三氯甲烷和95%乙醇(V/V)等均為分析純,甲醇為色譜純。

1.2儀器

WR-C微波樣品處理系統(tǒng)(北京盈安科技有限公司),RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),高效液相色譜儀(日本島津公司),DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),TCL-16G型電動離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),UV-2450型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3提取方法

1.3.1超聲提取法精確稱取神秘果種子粉5.0 g于錐形瓶中,加入50.0 mL正己烷溶解,并置于超聲波儀中提取4 h,蒸餾回收正己烷,所得浸膏狀物質(zhì)先后用水和氯仿洗滌,合并洗滌液,棄水層,氯仿層再用水洗滌6次,棄水層,揮發(fā)氯仿,殘余物用甲醇溶解,并定容至10 mL,待用。

1.3.2微波輔助提取法精確稱取神秘果種子粉2.0 g于燒杯中,用1 g CIP與之充分混合后轉(zhuǎn)入微波提取罐內(nèi),并添加15 mL正己烷,蓋上壓力蓋、密封、放入微波樣品處理系統(tǒng)中升溫,于120 ℃下保持12 min后,將提取液全部轉(zhuǎn)移并用少量正己烷清洗內(nèi)罐,合并清洗液和提取液,4 000 r/min離心5 min后,揮干上層清液,用甲醇溶解殘余物,定容至10 mL,待用。

1.4色譜條件

色譜柱為ODS Hyper2SIL C18(4.0 mm × 200 mm × 5 μm),流動相(甲醇∶水=90∶10,V/V),檢測波長為215 nm,柱溫為25 ℃,流速為1.0 mL/min。

1.5齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品3.00 mg,定容至10 mL,并逐級稀釋得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照上述色譜條件,進(jìn)樣20 μL,以峰面積定量。以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(mV*s)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,得回歸方程y=1 771.67x+12 809 600,相關(guān)系數(shù)0.999 8,SD=186.560 4,P<0.000 1。結(jié)果表明齊墩果酸在0.01~0.05 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1微波輔助提取法與超聲提取法的比較

采用微波輔助提取法與超聲提取法對神秘果種子中齊墩果酸的提取效果進(jìn)行比較,其HPLC譜圖見圖1、圖2。由峰面積計(jì)算不同方法提取的齊墩果酸含量,結(jié)果如表1所示。

從圖1、圖2及表1可以看出,微波輔助提取神秘果種子中齊墩果酸的效果較好,故后續(xù)研究主要分析了微波輔助提取神秘果種子中齊墩果酸的提取條件。

2.2微波輔助提取法單因素試驗(yàn)

2.2.1提取溶劑對提取率的影響分別以正己烷、95%乙醇(V/V)及兩者的混合溶液(1∶1,V/V)為提取劑進(jìn)行微波輔助提取實(shí)驗(yàn),研究不同溶劑對神秘果種子中齊墩果酸提取率的影響。

采用上述色譜條件測得提取不同溶劑獲得的齊墩果酸含量,結(jié)果見表2。由表2可知,正己烷的提取率最高,其次是二者的混合溶液,乙醇的提取效率最低。這表明齊墩果酸在非極性溶劑中有較好的溶解性,故本研究選擇正己烷作為提取溶劑。

2.2.2提取時間對提取率的影響精確稱取2 g神秘果種子粉,加入20 mL正己烷,按8、10、12、14、16 min等5個時間梯度進(jìn)行微波輔助提取實(shí)驗(yàn),考察不同提取時間對齊墩果酸提取效率的影響。

結(jié)果表明,提取時間短,則提取率低,隨著提取時間的延長,提取率逐漸增加,但到12 min后,增加趨于平緩。另一方面,提取時間的延長也會造成雜質(zhì)的干擾,所以最終確定12 min為最佳提取時間。

2.2.3提取溫度對提取率的影響精確稱取2 g神秘果種子粉,加入20 mL正己烷,分別采用5個不同提取溫度(100、110、120、130、140 ℃)進(jìn)行微波輔助提取試驗(yàn),結(jié)果見圖3。從圖3可知,提取率隨溫度升高而增大,至120 ℃達(dá)到最大值,其后提取率緩慢降低。這可能是隨著溫度的升高,分子熱運(yùn)動加快,浸出速度也隨之加快,但過高溫度可能會破壞齊墩果酸結(jié)構(gòu),也可能是溫度過高引起乙醇的揮發(fā),造成溶劑損失。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果,最終選擇120℃為最佳提取溫度。

2.3精密度試驗(yàn)

按1.3.2方法前處理,連續(xù)進(jìn)樣5次,每次進(jìn)樣20 μL,記錄峰面積。結(jié)果如表3所示。由表可知,其RSD=0.626 3%,表明本方法的精密度較好。

2.4重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批次樣品5份,按1.3.2方法進(jìn)行前處理,和色譜分析,結(jié)果如表4所示。由表4可知,其RSD=0.626 5%,表明本法重現(xiàn)性較好。

2.5HPLC分析

采用HPLC測定不同溶劑提取神秘果種子中的齊墩果酸,利用外標(biāo)法進(jìn)行定量,保留時間進(jìn)行定性,其色譜圖見圖4~7。

3小結(jié)與討論

通過對神秘果種子中齊墩果酸的提取方法、提取溶劑、提取時間、提取溫度等方面的考察,確定了微波輔助提取的最佳條件為:以正己烷為溶劑,液料比1∶10,在120 ℃下,經(jīng)過12 min提取。本試驗(yàn)結(jié)果表明,采用該方法的提取率高,提取時間短,為今后神秘果的工業(yè)化開發(fā)及深入研究提供了技術(shù)參考。

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